TIPE2在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達及其意義探究*

王　沫　董　蕾　趙菊輝　劉　欣

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(710004)

腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白8樣2(tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2, TNFAIP8L2, TIPE2)于2008年在小鼠自身免疫性腦脊髓炎動物模型中首次被篩選鑒定[1]，其高表達于小鼠免疫組織和免疫器官，在人體中則廣泛表達于各類組織和器官中[2]。大量實驗研究表明TIPE2在先天免疫和獲得性免疫中起重要負性調(diào)控作用，對于維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受具有重要意義[1]。潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)為消化系統(tǒng)常見病，是一種多因素參與的以免疫紊亂為特征的復(fù)發(fā)性腸道慢性炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機制尚未完全明確，根治困難，易反復(fù)發(fā)作。TIPE2作為重要的免疫負調(diào)控蛋白，可能參與了UC的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究通過檢測TIPE2在UC患者外周血和結(jié)腸黏膜中的表達情況，并與非UC個體進行對比，旨在探討TIPE2在UC 發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、標本來源

收集2015年1月—2016年8月就診于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院的活動期UC患者的外周血標本42例和結(jié)腸黏膜標本30例。入組患者UC均經(jīng)臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡特征和組織病理學(xué)檢查結(jié)果確診。收集同期消化道息肉患者外周血標本15例和健康體檢者、結(jié)腸息肉術(shù)后復(fù)診、痔瘡等非UC患者的結(jié)腸黏膜標本13例作為對照。采集入組UC患者的臨床資料，包括一般資料、病史、血常規(guī)、超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)、紅細胞沉降率(ESR)等。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，入組者對外周血和結(jié)腸黏膜標本采集均知情同意。

二、主要試劑

TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific)；Prime-ScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara Bio Inc.)；兔抗人TIPE2多克隆抗體(Abcam plc.)；山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；免疫組化SP試劑盒(西安赫特生物科技有限公司)。

三、方法

1. Real-time PCR：受檢者留取靜脈血5 mL，使用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)。TRIzol試劑提取PBMC總RNA，以PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取 2 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 行real-time PCR擴增。PCR引物序列：TIPE2，F(xiàn) 5’-GGC ACT TAG CTT TGG TGA GG-3’, R 5’-TGA GTG AAG TCA GGC CCA TA-3’，擴增產(chǎn)物198 bp；GAPDH(內(nèi)參)，F(xiàn) 5’-CTC CTC CAC CTT TGA CGC TG-3’, R 5’-TCC TCT TGT GCT CTT GCT GG-3’，擴增產(chǎn)物279 bp。TIPE2反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，熔解曲線95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s。以2-△△CT法計算TIPE2 mRNA相對表達量。每一樣本獨立重復(fù)實驗3次。

2. 免疫組化染色：結(jié)腸標本以40 g/L甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片；切片常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸鹽高溫修復(fù)抗原。按試劑盒說明書進行操作，行SP法免疫組化染色，以PBS代替一抗作為陰性對照。光學(xué)顯微鏡下閱片，每張切片于400倍視野下隨機采集3張圖像，Image-Pro Plus軟件定量分析TIPE2蛋白相對表達量，以平均光密度值(MOD值)表示。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)　　果

一、一般資料

采集外周血標本的42例UC患者根據(jù)True-love-Witts分型標準[3]，輕度15例，中度15例，重度12例。采集結(jié)腸標本的30例UC患者根據(jù)UC疾病活動度內(nèi)鏡和組織學(xué)分級標準[3]，輕度8例，中度12例，重度10例。外周血標本UC組、結(jié)腸標本UC組與相應(yīng)對照組間、不同嚴重程度外周血標本或結(jié)腸標本UC組間性別構(gòu)成、平均年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1、表2)。

表1　采集外周血標本UC患者一般資料

與對照組比較，*P=0.808,△P=0.240

表2　采集結(jié)腸標本UC患者一般資料

與對照組比較，*P=0.370,△P=0.205

二、采集外周血標本UC患者外周血炎癥指標比較

Truelove-Witts分型輕、中、重度UC組間外周血中性粒細胞百分比(NEUT%)、hsCRP、ESR差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035;P=1.83×10-4;P=0.006)。重度UC組NEUT%明顯高于輕度UC組；輕、中、重度UC組hsCRP隨病情加重呈上升趨勢；輕度UC組ESR明顯低于中、重度UC組(圖1)。

三、外周血TIPE2 mRNA表達

Real-time PCR結(jié)果顯示，UC組外周血TIPE2 mRNA相對表達量較對照組有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.625)。Truelove-Witts分型輕、中、重度UC組中，中度組TIPE2 mRNA表達最高，重度組次之，輕度組最低，但總體差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.969)(圖2)。分別以NEUT%、hsCRP、ESR的正常參考值為界值進行分組，比較不同NEUT%、hsCRP、ESR水平UC組間的TIPE2 mRNA表達差異，結(jié)果顯示組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.796;P=0.250;P=0.328)(圖3)。

四、結(jié)腸黏膜TIPE2蛋白表達

免疫組化染色結(jié)果顯示，UC組結(jié)腸黏膜TIPE2蛋白表達MOD值明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=1×10-6)。在組織學(xué)分級輕、中、重度UC組中， MOD值隨組織學(xué)分級的升高而升高，但總體差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.485)(圖4)。

圖2　UC患者外周血TIPE2 mRNA表達(real-time PCR)

討　　論

正常人腸道中有黏膜上皮屏障和先天免疫、獲得性免疫兩道屏障。UC時，這兩道屏障功能出現(xiàn)異常，無法抵御腸道微生物的侵襲。腸道微生物與黏膜免疫系統(tǒng)之間的相互作用失調(diào)導(dǎo)致效應(yīng)T細胞過度反應(yīng)，各類免疫細胞釋放大量炎癥因子長期作用于腸黏膜，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)免疫負調(diào)控蛋白TIPE2可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)、T細胞受體(TCR)、NF-κB、JNK、p38 MAPK、TAK1、Rac、 PI3K-AKT等信號通路實現(xiàn)對T細胞、 巨噬細胞、樹突細胞等免疫細胞的負性調(diào)控，從而下調(diào)促炎細胞因子表達，抑制免疫炎癥反應(yīng)[1,4-7]。同時，TIPE2還可促進M2型巨噬細胞分化[7]，并在調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)的免疫抑制功能中發(fā)揮重要作用[8]。但迄今為止，關(guān)于TIPE2在人類免疫炎癥相關(guān)疾病中作用的研究并不太多。既往研究顯示，TIPE2在免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、哮喘患者PBMC中的表達顯著降低[9-10]，乙型肝炎和原發(fā)性膽汁性肝硬化患者亦存在PBMC中TIPE2表達降低，并與血清轉(zhuǎn)氨酶水平呈顯著負相關(guān)[11-12]；但在強直性脊柱炎患者的外周血和糖尿病性腎病患者的腎臟組織中，TIPE2卻呈高表達[13-14]。上述TIPE2在不同疾病中差異表達的現(xiàn)象有待解釋，其發(fā)揮免疫負調(diào)節(jié)作用的具體機制尚需進一步研究予以揭示。

圖1　采集外周血標本UC患者輕、中、重度組間外周血炎癥指標比較

圖3　不同NEUT%、hsCRP、ESR水平UC組間外周血TIPE2 mRNA表達比較

A、C：對照組結(jié)腸黏膜中幾乎無TIPE2表達(A：×200，C：×400)；B：UC結(jié)腸黏膜中TIPE2表達陽性，腺上皮細胞和浸潤炎性細胞中均有TIPE2表達(×200)；D：輕度UC結(jié)腸黏膜中TIPE2弱陽性表達，腺上皮細胞和浸潤炎性細胞中均有TIPE2表達(×400)；E、F：中度UC結(jié)腸黏膜中TIPE2中等陽性表達，腺上皮細胞和浸潤炎性細胞中均有TIPE2表達(×400)；G：重度UC結(jié)腸黏膜中TIPE2強陽性表達(×400)；H：重度UC增生淋巴組織中TIPE2強陽性表達，表達定位于細胞質(zhì)(×400)

圖4不同組織學(xué)分級UC結(jié)腸黏膜TIPE2蛋白表達(免疫組化SP法)

本研究以活動期UC患者為研究對象，分別采集其外周血和結(jié)腸黏膜標本，并收集一般資料、病史、外周血炎癥指標等信息，分別按Truelove-Witts分型和組織學(xué)分級將患者分為輕、中、重度三組，采用real-time PCR和免疫組化染色檢測PBMC和結(jié)腸黏膜中的TIPE2表達。結(jié)果顯示UC組結(jié)腸黏膜TIPE2蛋白表達顯著高于對照組，在輕、中、重度組織學(xué)分級組間，其表達呈逐漸增高趨勢，但總體差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量較小有關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)提示TIPE2表達可能與UC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

本研究采集外周血標本UC患者分組所使用的Truelove-Witts分型標準中不包括NEUT%和hsCRP兩項指標，故對這兩項指標在不同嚴重程度UC組間的表達進行了比較，結(jié)果顯示不同嚴重程度UC組間hsCRP差異顯著，其水平隨病情加重逐漸升高，提示hsCRP能較好地反映UC病情嚴重程度。Real-time PCR結(jié)果顯示，UC組外周血TIPE2 mRNA表達雖較對照組有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，輕、中、重度組間總體差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。進一步比較不同NEUT%、hsCRP、ESR水平UC組間的TIPE2 mRNA表達差異，亦均未達統(tǒng)計學(xué)意義。關(guān)于TIPE2在結(jié)腸黏膜與外周血中的表達水平不一致的原因，可能有以下幾點。首先，各個生物學(xué)指標在血液和組織中的表達水平以及檢測技術(shù)的敏感性本身就存在差異。其次，本研究對采集外周血患者的分組依據(jù)是以臨床癥狀和實驗室指標為基礎(chǔ)的Truelove-Witts分型標準，而炎癥性腸病常存在內(nèi)鏡表現(xiàn)與臨床表現(xiàn)不平行的情況，也是造成該現(xiàn)象的可能原因之一。第三，樣本采集過程中由于各種客觀因素，采集結(jié)腸黏膜標本的患者與采集外周血標本的患者幾乎無重疊，可能在一定程度上影響實驗結(jié)果。此外，由于我國UC患病率不高，短時間內(nèi)難以獲取足量樣本，樣本量不足同樣會造成實驗結(jié)果的偏倚。最后，本研究樣本來源病例幾乎未涉及初發(fā)患者，入組患者或多或少接受過不同形式和程度的治療，因此檢測結(jié)果可能不能準確反映UC自然病程下的TIPE2表達情況。如不受治療干擾，TIPE2可能會更大程度地在結(jié)腸局部參與UC疾病進程。

結(jié)腸局部TIPE2表達增高可能是免疫系統(tǒng)的負反饋調(diào)節(jié)，也可能是免疫功能失調(diào)的表現(xiàn)，其表達增高可抑制免疫系統(tǒng)對細菌等病原體的防御能力，病原體侵襲使黏膜破壞進一步加重。有研究[15]以葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠急性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)TIPE2-/-小鼠結(jié)腸炎癥和損傷均明顯減輕，炎性細胞浸潤減少，促炎細胞因子表達顯著降低，深究TIPE2-/-小鼠抵抗DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的原因，可能與結(jié)腸局部共生細菌播散受抑和系統(tǒng)性炎癥減輕有關(guān)，證實TIPE2對抗菌免疫起負向調(diào)控作用。

綜上所述，UC患者結(jié)腸局部TIPE2表達增高，其可能通過免疫負調(diào)控作用抑制炎癥反應(yīng)以及抑制抗菌免疫參與UC的發(fā)生、發(fā)展。TIPE2在UC中的具體作用機制仍有待進一步研究證實。

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