劉　杰, 張瀟雅, 鄧　馨

(1.濰坊科技學院賈思勰農(nóng)學院設施園藝實驗室，山東 壽光 262700；2.中國科學院植物研究所北方資源植物重點實驗室，北京 100093)

隨著全球氣候變化，大范圍持續(xù)性嚴重干旱已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最嚴重威脅.21世紀以來，重大干旱在我國主要糧食產(chǎn)區(qū)頻繁發(fā)生，對尚在營養(yǎng)生長階段的幼苗造成嚴重傷害，導致其光合受抑、生長停滯、干枯甚至死亡，產(chǎn)量嚴重降低甚至絕收，造成了巨大的經(jīng)濟損失，對農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境造成威脅.與大多數(shù)植物不同，一些植物因為在特殊生境中長期進化獲得了特有的抵御某些逆境的能力，例如全球僅有的大約200種“復蘇被子植物”，它們的營養(yǎng)組織可以長期忍耐干旱脫水，且在遇水后仍可迅速恢復正常生長[1].苦苣苔科旋蒴苣苔屬植物牛耳草(Boeahygrometrica)，即是一種廣泛分布于東南亞的復蘇被子植物，植株耐干旱脫水，甚至其離體葉片或葉片的一部分均耐旱，并在遇水后復蘇，幾天內(nèi)即可恢復正常生活狀態(tài).研究已證實這類植物中可能蘊藏著一些特殊的逆境保護與調(diào)控機制，因其本身屬于種子植物，與農(nóng)作物和經(jīng)濟作物結構和發(fā)育過程甚至分子調(diào)控機制相同，故此研究復蘇植物的這些特殊機制可為提高作物對水分脅迫的抗性提供新思路和新技術.

近年來，植物表觀遺傳學成為研究熱點，研究表明表觀遺傳學在植物生長發(fā)育過程中起著極其重要的作用，主要是通過DNA甲基化、蛋白質(zhì)共價修飾、非編碼RNA的調(diào)控、染色質(zhì)重塑和基因印記等機制調(diào)控植物的生長發(fā)育.而DNA甲基化是表觀遺傳學中發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的內(nèi)容之一，它不僅參與植物個體發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控, 而且還是基因組防御、親本印跡、副突變、轉(zhuǎn)基因沉默等表觀遺傳現(xiàn)象的主要機制[2,3].植物體內(nèi)DNA甲基化動態(tài)也受到植物生理生態(tài)、發(fā)育階段及環(huán)境刺激等多種因素的影響[2].甲基化狀態(tài)的改變可啟動植物體內(nèi)與逆境相關基因的表達以及某些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座，從而提高植物對脅迫的抗性.DNA甲基化參與植物適應干旱基因表達的調(diào)控已在模式植物和作物中被證實[4-6]，但DNA甲基化是否參與調(diào)控復蘇植物干旱復蘇過程還未見研究，因此，本研究利用MSAP技術分析牛耳草干旱復蘇過程中的DNA甲基化水平和狀態(tài)的變化及規(guī)律，為深入探討DNA甲基化在牛耳草干旱復蘇應答過程中的作用提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1　材料

復蘇植物旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)，俗名牛耳草，種子采自北京植物園櫻桃溝.取種子進行組織培養(yǎng)，待植株生長到一定階段移至土中培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為25 ℃±2 ℃，相對濕度為50%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗.

1.2　方法

1.2.1不同處理條件下牛耳草表型觀察干旱脅迫處理：挑選生長均勻一致的牛耳草12盆(每盆1株)，平均分為4組，每組3個重復.其中Ⅰ組作為對照組(F)，Ⅱ組干旱處理5 d(SD5)，Ⅲ組干旱處理14 d(SD14)，Ⅳ組干旱處理14 d后復水3 d(A)，每組在干旱處理前1 d均充分澆足水.處理過程中時刻觀察牛耳草的生長狀態(tài)與表型差異并拍照.

1.2.2基因組DNA提取從各處理組的3株牛耳草上取葉片，混合后，迅速置于液氮中備用.采用改良的CTAB法提取基因組DNA[7].用1%的瓊脂糖凝膠檢測提取的牛耳草基因組DNA的質(zhì)量，用NanoDrop儀(NanoDrop 2000, Thermo Scientific)檢測提取的基因組DNA的濃度與純度，剩余DNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)分析MSAP主要步驟及體系:實驗采用的接頭引物、預擴增引物及選擇性擴增引物見表1.接頭和引物序列由上海生工合成.酶切反應體系25 μL(2.5 μL 10×NEBuffer，5UMspⅠ/HpaⅡ，5UEcoRⅠ，500 ng的基因組DNA)，37 ℃下酶切7 h，80 ℃下孵育30 min，使酶失活.接頭連接體系28 μL(雙酶切產(chǎn)物20 μL，EcoRⅠ接頭EA1、EA2各5×10-6μmol，MspⅠ/HpaⅡ接頭H/MA1、H/MA2各5×10-5μmol，T4 DNA ligase 0.8 U，10×T4 Ligation buffer 2.8 μL)，16 ℃連接12 h.將連接產(chǎn)物稀釋10倍作為預擴增反應的模板，反應體系為25 μL (10 μL 2×TaqPCR MasterMix，3 μL連接產(chǎn)物，5×10-6μ mol預擴增引物E0，5×10-6μmol預擴增引物H/M0)，擴增程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min.預擴增產(chǎn)物稀釋20倍用于選擇性擴增模板，反應體系與預擴增反應相同，引物為表1中的選擴增引物組合(共25對引物組合).擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s(每循環(huán)降低0.7 ℃)，72 ℃ 1 min，共13個循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 23個循環(huán)；72 ℃ 10 min.選擇擴增產(chǎn)物變性后進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，硝酸銀染色后進行H(EcoRⅠ/HpaⅡ)和M(EcoRⅠ/MspⅠ)泳道條帶數(shù)及帶型統(tǒng)計分析.

1.3　RNA提取及第一鏈cDNA合成

用總RNA提取試劑盒(Trizol Reagent, TaKaRa)提取牛耳草葉片總RNA，并用DNaseⅠ(TaKaRa)純化.按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)說明書合成第一鏈cDNA，作為熒光定量PCR的模板.

1.4　Real-time PCR反應

采用Eppendrof公司Realplex2 PCR儀來實時定量檢測基因表達.qPCR反應體系10 μL(2×SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 5.0 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，cDNA模板0.4 μL，RNase-free H2O補足體積到10 μL).反應程序為：95 ℃預變性1 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，進行40個循環(huán).擴增結束后繪制溶解曲線，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，從55 ℃逐漸升溫至95 ℃ 20 min，95 ℃ 15 s.以18S rRNA為內(nèi)參基因，qRT-PCR所用引物序列見表2.

表1　MSAP分析中使用的接頭、預擴增及選擇擴增引物序列Table 1　Adaptors, pre-amplification primers and selective primers in MSAP analysis

1.5　數(shù)據(jù)處理與分析

表2　qRT-PCR所用引物Table 2　Primers used in qRT-PCR

在MSAP試驗中，只對條帶清晰、與引物組合篩選時一致的條帶進行統(tǒng)計.在膠板上的1個特定位點，對每個樣本來說，有條帶的記為“1”，沒有條帶的記為“0”.本次試驗采用3次重復，所有數(shù)據(jù)處理及分析均使用SPSS 19.0完成，柱狀圖均由Origin 8.0完成.

2　試驗結果

2.1　不同干旱處理條件下牛耳草表型差異

研究表明，干旱處理5 d的牛耳草葉片開始萎蔫；干旱處理14 d的牛耳草失去大部分水分，葉片變得干硬卷縮，呈現(xiàn)一種典型的復蘇植物特有的類似脫水休眠的狀態(tài)；對干旱處理14 d的牛耳草進行復水處理3 d后，牛耳草基本恢復原來的生活狀態(tài)(圖1).

圖1　不同處理下牛耳草狀態(tài)Fig.1　Status of Boea hygrometrica plants during dehydration and rehydration

2.2　不同干旱處理對牛耳草甲基化水平的影響

樣品全基因組DNA經(jīng)EcoRⅠ/HpaⅡ(H)和EcoRⅠ/MspⅠ(M)兩組限制性內(nèi)切酶組合酶切后，其產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測到3種甲基化類型：Ⅰ.H有帶，M無帶，代表CCGG位點發(fā)生單鏈外部甲基化(CHG甲基化/半甲基化)；Ⅱ.H無帶，M有帶，代表CCGG位點發(fā)生雙鏈內(nèi)部甲基化(CG甲基化/全甲基化)；Ⅲ.H和M組合都有帶，代表CCGG位點未甲基化.

利用5條EcoRⅠ引物和5條HpaⅡ/MspⅠ引物組合成25對引物，篩選出5對擴增效果較好且結果穩(wěn)定的引物組合(表1).對不同干旱復水條件下牛耳草葉片DNA的甲基化水平進行了MSAP分析，分析100～750 bp的條帶.結果表明，在所有處理樣品中甲基化水平均在50.65%～60.82%范圍內(nèi).由對照組F結果可知，牛耳草在新鮮狀態(tài)下CCGG位點的甲基化水平約為50.65%，在干旱處理后，CCGG位點甲基化水平明顯升高，并且在干旱5 d時，甲基化水平最高達到60.82%；而干旱14 d時，牛耳草甲基化水平又降低到與新鮮狀態(tài)相當?shù)乃?，?0.94%；復水3 d后甲基化水平略微上升，為53.12%(表3).無論哪種狀態(tài)，牛耳草葉片甲基化位點均以Ⅰ型CHG(半甲基化)位點為主，占約32.3%～40.2% (圖2).

表3　不同干旱條件牛耳草葉片基因組DNA甲基化水平1)Table 3　Levels of major types of MSAP profiles in leaves of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

1)F代表新鮮對照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復水3 d.

2.3　不同干旱處理下牛耳草葉片DNA甲基化變化類型

F代表新鮮對照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復水3 d.圖2　不同干旱處理下牛耳草葉片DNA甲基化水平Fig.2　Levels of major types of DNA methylation calculated based on the MSAP profiles in leaves of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

當同一個CCGG位點的MSAP條帶在不同處理條件下發(fā)生變化，就說明此位點的甲基化模式發(fā)生了變化.為揭示牛耳草在干旱復蘇過程中甲基化變化的程度和類型，本文將可檢測到的條帶變化進一步分為10個亞類(表4).A類是干旱脅迫時牛耳草基因組甲基化水平上升的條帶，即發(fā)生了甲基化(methylation)，包括5個亞類；B類是與對照相比，甲基化水平下降，即發(fā)生了去甲基化(demethylation)，包括5個亞類.(表3，圖3).

以F樣品為對照，對SD5、SD14、A的甲基化變化進行統(tǒng)計，從表3中可以看出，SD5、SD14以及A多態(tài)性條帶數(shù)分別為55、64、69條，分別占擴增總條帶數(shù)的56.70%、60.37%、71.88%.其中SD5時有18條發(fā)生甲基化升高，37條發(fā)生去甲基化；SD14時有15條發(fā)生甲基化升高，49條發(fā)生去甲基化；A時有26條發(fā)生甲基化升高，43條發(fā)生去甲基化.這些甲基化變異主要集中在CG位點，且主要以去甲基化為主(圖4).

表4　不同干旱處理下牛耳草CCGG位點甲基化模式的變異1)Table 4　Change of DNA methylation pattern in CCGG sites of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

1)+:有帶，-:無帶；H和M分別表示EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ酶切組合.

H代表EcoRⅠ/HpaⅡ限制性內(nèi)切酶組合酶；M代表EcoRⅠ/MspⅠ限制性內(nèi)切酶組合酶；F代表新鮮對照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復水3 d.圖3　不同干旱處理下牛耳草葉片MSAP示意圖Fig.3　Examples of MSAP profiles in leaves of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

F代表新鮮對照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復水3 d.圖4　不同干旱處理下牛耳草葉片CCGG位點甲基化變化類型差異Fig.4　Variation in the major methylation patterns, including CG, CHG, simultaneous CG/CHG types in leaves of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

2.4　不同干旱處理下牛耳草DNA甲基化酶相關基因表達情況

利用前文報道的牛耳草芯片數(shù)據(jù)[8](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，NO.GSE53058)進行分析，發(fā)現(xiàn)2個與DNA甲基化相關的酶編碼基因在干旱及復蘇過程中表達發(fā)生變化.根據(jù)cDNA序列設計引物，利用實時熒光定量PCR驗證上述2個基因在牛耳草干旱及復蘇過程中的表達情況，BhDnmt2 (DNA methyltransferase 2)在干旱5 d時表達量急劇上升，而干旱14 d時幾乎不表達，復水后表達量又明顯增加；而BhCMT2 [DNA (cytosine-5) methyltransferase]在干旱過程中下降，尤其是干旱14 d時，但在復水后表達量有明顯升高.這些數(shù)據(jù)與芯片數(shù)據(jù)趨勢吻合(數(shù)據(jù)未列出).

3　討論

牛耳草在遭受干旱脅迫后葉片會迅速失水并向葉柄方向卷曲，以休眠狀態(tài)生存；當澆水后逆轉(zhuǎn)，恢復正常的生長狀態(tài)，這種表型變化對于牛耳草適應極端干旱環(huán)境具有重要作用.轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)與信號途徑、保護蛋白(包括LEA蛋白和分子伴侶等)、活性氧清除、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和自噬等過程相關的大量基因在干旱復水過程中表達發(fā)生變化，上調(diào)或者下調(diào)，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控牛耳草抗旱生理反應，最終保障其在脫水狀態(tài)下存活并在水分條件恢復后復蘇[8].

F代表新鮮對照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復水3 d.圖5　不同干旱處理下牛耳草DNA甲基化酶相關基因的表達變化Fig.5　The expression changes of DNA methylation related genes in B.hygrometrica during dehydration and rehydration

DNA甲基化水平的變化是影響基因表達的重要表觀調(diào)控機制.MSAP分析結果顯示，牛耳草甲基化水平較高，在50.65%～60.82%之間.研究表明，甲基化水平與物種基因組復雜性密切相關，甲基化的DNA絕大多數(shù)由轉(zhuǎn)座子和其他重復序列構成；重復序列多的基因組，甲基化水平程度亦較高[9].而牛耳草基因組較大，約1.691×109bp，包含了75.75%的重復序列(主要是轉(zhuǎn)座子序列)[10]，這些重復序列可能發(fā)生甲基化而失去活性，因此導致牛耳草的甲基化水平相對較高.

環(huán)境刺激，諸如干旱、冷、熱、鹽害等都會引起植物DNA甲基化狀態(tài)的改變[11-14].多數(shù)脅迫情況下植物總甲基化水平會降低[14-17]；但在本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫初期牛耳草DNA甲基化水平卻升高，這可能是復蘇植物所特有的變化特征，推測有助于一些特定基因的表達抑制；而干旱脅迫后期，DNA甲基化總體水平降低，可能有助于一些脫水特異性基因的表達誘導；復水3 d后，盡管牛耳草表型基本恢復，但CG位點甲基化水平仍明顯高于未處理組，這說明牛耳草基因組特定位點仍被DNA甲基化控制.牛耳草基因組DNA甲基化水平在其干旱復蘇過程中發(fā)生明顯改變，表明DNA甲基化很可能參與調(diào)控牛耳草干旱相關基因的表達；并且由半甲基化和全甲基化條帶比例可推測，半甲基化調(diào)控在牛耳草抗旱過程中作用可能更明顯.

DNA甲基化和去甲基化，與轉(zhuǎn)錄的抑制或激活密切相關；甲基化抑制基因的表達，去甲基化可能激活基因的轉(zhuǎn)錄[18-21].而DNA甲基化主要是通過DNA甲基化相關酶來催化完成.目前植物中已鑒定的甲基轉(zhuǎn)移酶亞家族有4類：methylatransferase (MET)、chromomethyltransferse (CMT)、domain-rearranged methyltransferase (DRM)以及DNA methyltransferase homologue 2 (DNMT2)，這4類酶共同維持著植物體內(nèi)DNA甲基化[22].在本研究中，干旱處理過程中甲基化發(fā)生變異的位點主要以CG位點為主，且去甲基化程度大于甲基化程度，暗示表達被激活的基因可能多于抑制的基因.通過本研究qRT-PCR檢測的BhDnmt2、BhCMT2的表達情況也能看出，牛耳草為了適應干旱脅迫，通過體內(nèi)多個甲基化相關酶來參與牛耳草基因組DNA甲基化水平調(diào)控，進而增強其適應干旱脅迫的能力，但具體各個酶之間是如何協(xié)調(diào)還應進一步研究.

4　結論與展望

干旱復蘇過程中，牛耳草DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生變化，總甲基化水平在脅迫初期明顯升高，發(fā)生甲基化/去甲基化的位點占總擴增位點的50%.這些變化表明DNA甲基化可能參與了牛耳草抗旱復蘇過程，是旋蒴苣苔干旱抗性反應系統(tǒng)的一個環(huán)節(jié).通過MSAP檢測到不同干旱脅迫處理下牛耳草基因組中的胞嘧啶甲基化存在差異,這些差異片段與牛耳草響應干旱脅迫是否有關，具體涉及到哪些基因，尚需進一步研究證實.這就需要對許多5′-CCGG-3′被甲基化修飾的序列進行分離以及基因功能的研究，以便更準確深入地理解干旱脅迫下基因組DNA的甲基化和逆境適應機制的聯(lián)系.

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