李　蕊, 儀慧蘭

山西大學生命科學學院, 太原　030006

硫是維持植物生命活動的必需元素,與植物的生長發(fā)育、逆境生理密切相關。植物可以吸收空氣中的SO2作為硫營養(yǎng)來源,尤其在土壤含硫不足時。但大氣中SO2濃度過高時,會影響植株生理。環(huán)境高濃度SO2會使葉面氣孔關閉,繼而影響光合作用和呼吸過程,導致植株生長發(fā)育抑制[1- 2]。SO2暴露引發(fā)植物體氧化脅迫[1],高水平活性氧(ROS,Reactive Oxygen Species)可破壞生物大分子的結構和功能,使細胞生理功能紊亂,甚至死亡[1,3- 4]；但作為信號分子,ROS還能介導氣孔運動、基因轉錄[5- 7]等,調節(jié)植物對環(huán)境的適應。

基因轉錄調節(jié)是植物適應環(huán)境的基礎。芯片檢測發(fā)現(xiàn),SO2暴露引發(fā)的擬南芥差異表達基因主要涉及細胞代謝、結合、轉錄調控、信號轉導、物質運輸?shù)萚8- 9],其中一些基因在干旱脅迫時亦發(fā)生轉錄應答,但植物對環(huán)境化學物SO2的響應,能否影響其干旱生理未見報道。植物對干旱的響應包括依賴脫落酸(ABA,Abscisic Acid)和不依賴ABA的兩條途徑,CBF4和DREB2分別是這兩條途徑中的關鍵轉錄因子,二者均受干旱誘導上調表達,并共同調控下游基因RD29A的表達[10- 11]。擬南芥DREB2包括DREB2A和DREB2B,均可被干旱誘導,進而激活RD29A表達,增強植物的抗旱性[10,12],DREB2A、DREB2B和RD29A轉錄應答是植物干旱響應的標志。熱激蛋白(Hsp)是植物體內普遍存在的一類受干旱和其他刺激后大量表達的蛋白,在干旱生理中具有重要的調控作用,參與細胞內蛋白折疊、分布及降解過程,維持細胞蛋白質穩(wěn)態(tài),保護細胞免受脅迫損傷[13- 15]。氣孔關閉會使葉片局部升溫,但植物暴露于SO2時發(fā)生的氣孔開度縮小是否能激活Hsp尚不清楚,植物對SO2的響應是否與干旱響應基因有關未見報道。

植物遭遇某種非致死性不良環(huán)境后,會增強抵御這種特定環(huán)境的能力,還能產生防御其他不良環(huán)境的能力,稱為植物的交叉適應[16]。研究表明,植物對熱激-干旱、低溫-干旱、干旱-鹽漬存在交叉適應[17- 20]。大氣污染物SO2和干旱是植物遭遇的兩種常見的非生物脅迫,植物對SO2和干旱是否存在交叉適應未見報道。因此,本文以模式植物擬南芥為材料,研究SO2暴露對植物干旱生理的影響,分析植株干旱生理指標與干旱響應基因表達水平的變化,探討SO2暴露在植物應對干旱脅迫過程中可能發(fā)揮的作用。

1　材料與方法

1.1　材料準備及SO2熏氣處理

取擬南芥(ArabidpsisthalianaL.)Columbia野生型種子,4℃春化2d后播種于營養(yǎng)土中。置于培養(yǎng)間培養(yǎng),光照度≥3000lx,光/暗周期為16h/8h,培養(yǎng)溫度22℃,相對濕度約60%。

取4周齡擬南芥植株,設SO2熏氣組和對照組,分別置于體積0.45m3的密閉箱內,適應1d后采用靜態(tài)熏氣方式進行SO2暴露。根據(jù)課題組前期研究結果,濃度30mg/m3的SO2暴露72h可對擬南芥植株產生一定的生長抑制效應并誘發(fā)抗氧化防御應答[1,9],本文選用30mg/m3的SO2。根據(jù)K2S2O5+2HCl→2KCl+H2O+2SO2的原理,定量產生SO2氣體,同時采用甲醛吸收副玫瑰苯胺分光光度法測定SO2濃度,使箱內濃度保持在30mg/m3。每天熏氣16h,熏氣期間保持光照度。

1.2　氣孔開度測量

取SO2熏氣6、48、72h及同期對照組擬南芥植株的第三層平展葉片,蒸餾水洗凈,用透明膠帶粘取非葉脈部分的下表皮,并用毛刷刷去附于其上的葉肉細胞,固定于載玻片上,光學顯微鏡下觀察,OLYMPUS DP72數(shù)碼成像系統(tǒng)采集圖像,用軟件DP2-BSW測量氣孔開度。每個實驗組取5棵不同植株上的葉片,每片表皮上隨機選取20個視野(40×),每個視野測量10個氣孔的開度。

1.3　生理指標檢測

選SO2熏氣3d的擬南芥與同期非熏氣對照組植株進行干旱處理。將非熏氣對照組植株分為干旱組(干旱)和對照組,干旱組與SO2熏氣后干旱組(SO2+干旱)不再澆水,對照組適時澆水。在干旱脅迫6d時取植株地上部分,參照Ajithkumar等[21]的方法測定可溶性糖含量,參照Hao等[22]的方法測定脯氨酸和丙二醛(MDA)含量,參照李合生[23]的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性,參照Shi等[24]方法測定葉片相對含水量。

1.4　RT-PCR分析

取SO2熏氣48h和72h及同期對照組擬南芥植株地上部分,采用Trizol法提取RNA。以總RNA為模板,用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金生物技術有限公司)反轉錄合成cDNA,采用特異性引物(表1)擴增目標基因序列。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)所帶軟件Image Lab分析擴增帶譜的灰度值,計算基因擴增帶譜灰度值和內參基因Actin2灰度值的比值,作為基因的相對表達量。

表1　RT-PCR引物序列

圖1　SO2對擬南芥氣孔開度的影響　Fig.1　Effect of SO2 on stomatal aperture in Arabidopsis leaves圖中不同字母表示組間差異顯著

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

取3次生物學重復的平均值和標準誤,F檢驗后,采用Duncan方法進行多重比較,分析不同處理組與對照組之間的差異顯著性。圖中用相同字母表示差異不顯著,不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2　結果

2.1　SO2對擬南芥氣孔開度及熱激基因轉錄的影響

正常生理狀態(tài)下植株葉面氣孔維持一定開度及運動節(jié)律,以有效進行胞內外氣體和水分的交換,滿足植株的生長發(fā)育需要。30mg/m3的SO2暴露6h后擬南芥葉面氣孔開度顯著小于對照組,降幅為17.00%,隨著SO2暴露時間的延長,氣孔開度逐漸縮小,暴露72h時氣孔開度降幅為24.40%,說明SO2暴露能引發(fā)擬南芥氣孔關閉(圖1)。

SO2脅迫誘發(fā)葉面氣孔關閉,可以減少植株對SO2氣體的進一步攝入。但葉面氣孔開度減小,氣體交換速率降低,會導致葉片內部熱應激。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),擬南芥SO2暴露48h后地上組織中熱激轉錄因子HsfA2及其靶基因Hsp17.7、Hsp17.6B轉錄上調,SO2暴露72h后HsfA2及其靶基因Hsp17.7、Hsp17.6B、Hsp17.6C的轉錄上調幅度大于48h暴露組,均與對照組產生明顯差異(圖2)。結果說明,SO2能誘導擬南芥熱激基因轉錄上調,發(fā)揮對逆境生理的調節(jié)作用。

圖2　SO2對擬南芥熱激基因表達的影響 Fig.2　Effect of SO2 on expression of heat shock genes in Arabidopsis shoots圖中不同字母表示組間差異顯著

2.2　SO2對擬南芥干旱生理的影響

從植株外形上看,干旱初期SO2+干旱組與干旱組無明顯差異,隨著干旱時間的延長兩個干旱組間的差異逐漸增大。干旱6d后,干旱組擬南芥植株葉片萎蔫發(fā)黃,基部葉片出現(xiàn)枯死,而SO2+干旱組葉片萎蔫程度較輕,發(fā)黃葉片數(shù)和發(fā)黃度低于干旱組(圖3),對照組、干旱組和SO2+干旱組的葉片相對含水量分別為94%、68%和78%,表明SO2預暴露能增強擬南芥植株對干旱的適應能力。

干旱6d后,SO2+干旱組與干旱組相比,可溶性糖和脯氨酸含量顯著升高25.75%和112.33%,MDA含量顯著降低23.62%,SOD活性顯著升高26.32%(圖4),表明SO2能夠促進滲透調節(jié)物質的積累,提高抗氧化酶活性,降低干旱誘發(fā)的氧化損傷,進而增強擬南芥植株對干旱的適應性。

圖3　SO2對擬南芥干旱脅迫植株外形的影響Fig.3　Effect of SO2 on morphology of Arabidopsis plants under drought stress

圖4　SO2對干旱脅迫中擬南芥地上組織生理指標的影響Fig.4　Effect of SO2 on physiological indexes of Arabidopsis shoots under drought stress圖中不同的小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05)；SO2 +非干旱組與非干旱對照組無顯著差異;A： 對照Control；B：干旱Drought；C：SO2 +干旱SO2 + drought;SOD：超氧化物歧化酶superoxide dismutase；MDA：丙二醛malondialdehyde

圖5　SO2對擬南芥干旱響應基因表達的影響Fig.5　Effect of SO2 on expression of drought-responsive genes in Arabidopsis shoots圖中不同字母表示組間差異顯著

2.3　SO2對擬南芥干旱響應基因轉錄的影響

為分析SO2暴露與植物干旱脅迫應答的關系,檢測了SO2對擬南芥干旱響應基因轉錄的影響,發(fā)現(xiàn)干旱響應轉錄因子DREB2A、DREB2B及其下游基因RD29A在SO2暴露組均表達增強(圖5),表明SO2能提高擬南芥干旱響應基因的表達量,從而調節(jié)和增強植株對干旱的適應能力。

3　討論

氣孔調控著植物與外界環(huán)境之間的氣體與水分交換,在植物的生命活動中發(fā)揮著重要作用。大氣SO2濃度較高時植物葉面氣孔開度減小,以減少對SO2的吸收,但卻影響了葉片的氣體交換速率和蒸騰作用,引起葉片組織細胞溫度升高。熱刺激能誘導植物Hsp表達增強,其中小分子熱激蛋白(sHsps)對逆境適應具有重要作用。sHsps可修復受損蛋白,參與胞內蛋白折疊、分布及降解過程,維護蛋白質穩(wěn)態(tài)；sHsps參與對氧化脅迫的響應,能調節(jié)基因轉錄,提高植物逆境適應性[13- 15,25- 26]。擬南芥熱激轉錄因子HsfA2及其靶基因Hsp17.7、Hsp17.6B、Hsp17.6C在SO2熏氣組轉錄上調,可促使其編碼蛋白的水平升高,繼而對干旱等相關的逆境生理過程發(fā)揮積極的調節(jié)作用。SO2暴露時間延長時這些熱激基因上調幅度增大,可能與SO2暴露期間持續(xù)的氣孔關閉導致熱脅迫增強有關。

干旱條件下植物會主動積累脯氨酸、可溶性糖等滲透調節(jié)物質,通過調節(jié)細胞滲透勢、提高細胞保水能力、維持細胞膨壓等使植株得以在干旱條件下生存[24]。研究發(fā)現(xiàn),SO2+干旱組擬南芥的萎蔫程度低于單純干旱組,植株相對含水量、脯氨酸和可溶性糖含量均顯著高于單純干旱組,說明SO2能促進植物細胞合成和積累更多的滲透調節(jié)物質,從而提高干旱條件下細胞的滲透調節(jié)能力,減少干旱期間植株的水分散失,提高逆境適應性。滲透調節(jié)物質脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等參與介導植物對低溫-干旱、干旱-鹽和熱激-干旱的交叉適應[17- 20],本研究表明滲透調節(jié)物質在植物對SO2-干旱交叉適應中同樣具有重要作用。

根據(jù)前期研究結果[1],本研究選用一定的SO2暴露方式促使擬南芥植株產生抗氧化防御應答,導致了后期的干旱適應性提高,及干旱期間抗氧化酶SOD活性升高和膜脂氧化產物MDA水平下降,說明SO2激活細胞抗氧化能力在介導植株干旱適應過程中發(fā)揮了重要作用。SO2激活擬南芥抗氧化酶,可有效降低干旱引發(fā)的氧化脅迫,減輕細胞氧化損傷效應,使MDA含量降低。該結果與郭麗紅等報道的抗氧化酶參與介導玉米幼苗交叉適應性的結果[27]相似,說明抗氧化酶活性提高是植物交叉適應性產生的重要基礎。

為進一步證實SO2可誘發(fā)植物對干旱的適應,本文檢測了擬南芥干旱響應基因DREB2A、DREB2B和RD29A的轉錄水平,證實SO2能使擬南芥DREB及其靶基因RD29A上調表達。因此,擬南芥干旱響應基因轉錄的改變?yōu)镾O2誘發(fā)植株干旱適應性提高提供了直接的證據(jù)。有報道稱DREB2A參與調節(jié)植株失水和熱脅迫應答[28],本研究中SO2誘導的氣孔關閉及由此引發(fā)的熱脅迫可能是DREB轉錄應答的重要誘因。

高濃度SO2使植物氣孔關閉、抗氧化酶活性提高、抗氧化防護基因轉錄應答[1,8- 9,29],不僅產生了對SO2的適應,還介導了植株對干旱的適應性提高,出現(xiàn)了交叉適應。SO2脅迫使植物體內ROS水平升高[1,3],而ROS升高可介導擬南芥HsfA2和Hsps轉錄上調[30],誘發(fā)DREB2轉錄應答[10],因此ROS應該是SO2和干旱脅迫共同的信號分子。作為信號分子,ROS參與調節(jié)植物生長發(fā)育和逆境適應,并參與植物的交叉適應[16- 17],但有關調節(jié)機制有待進一步深入研究。

本文結果與之前發(fā)現(xiàn)的SO2衍生物預處理提高干旱條件下小麥種子萌發(fā)率、增強谷子幼苗干旱適應性[31- 32]的結果相似,其中均涉及SO2誘導的植株抗氧化酶活性增強,滲透調節(jié)物質脯氨酸和可溶性糖等含量提高,表明這些過程參與介導植物的干旱適應性。本文發(fā)現(xiàn)SO2能誘發(fā)植物干旱響應轉錄因子DREB2及其靶基因RD29A、熱激轉錄因子HsfA2及其靶基因sHsps的轉錄應答,為SO2介導干旱適應性產生提供了新的證據(jù)。但交叉適應性產生可能涉及植物細胞內包括信號識別、基因轉錄調控、代謝改變等眾多環(huán)節(jié),詳細機制有待進一步的研究。植物生存期間會面臨多種環(huán)境刺激,適應復雜多變的環(huán)境條件是植物生存的必須,而交叉適應性的出現(xiàn)是植物適應環(huán)境的一條有效途徑。本結果揭示了植物對大氣污染物和干旱的交叉適應性,為同類研究提供了新的實驗依據(jù)。

4　結論

植物暴露于大氣中較高濃度的SO2時,通過氣孔關閉減少對SO2的進一步攝入,而基因轉錄應答從根本上調節(jié)著植物對環(huán)境的適應。30mg/m3的SO2能誘導植物氣孔關閉,使熱激基因轉錄,干旱響應基因激活,抗氧化能力提高,這些改變?yōu)橹参飸獙Ω珊淡h(huán)境提供了基礎條件。SO2預暴露能促進植株干旱生理期間積累更多的滲透調節(jié)物質脯氨酸和可溶性糖,使葉片相對含水量顯著高于單純干旱組,植物的干旱適應性得以增強。擬南芥植株在SO2預暴露后對干旱的適應性提高,說明植物對SO2和干旱產生了交叉適應。

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