夏 志，趙 艷，尚畫雨，楊力源，付 玉，孫君志，蘇全生

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有氧訓(xùn)練聯(lián)合補(bǔ)充亮氨酸對(duì)增齡小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的影響

夏 志1，趙 艷1，尚畫雨2，楊力源3，付 玉2，孫君志2，蘇全生2

1.井岡山大學(xué) 體育學(xué)院, 江西 吉安 343009; 2.成都體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院, 成都 610041; 3.成都大學(xué) 體育學(xué)院, 四川 成都 610106。

目的：探討有氧訓(xùn)練聯(lián)合補(bǔ)充亮氨酸對(duì)增齡小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成與降解代謝的影響及機(jī)制。方法：將32只13月齡雄性CD-1?小鼠隨機(jī)納入安靜對(duì)照組（Sed組）、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組（Tra組）、補(bǔ)充亮氨酸組（Leus組）和補(bǔ)充亮氨酸+訓(xùn)練組（Leu T組），其中，亮氨酸以5%劑量進(jìn)行補(bǔ)充，訓(xùn)練方案為以自體重3%的負(fù)荷進(jìn)行45 min游泳，每周訓(xùn)練6 天，共計(jì)8 周。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)與磷酸化率，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定血清炎性細(xì)胞因子含量，氨基酸分析儀檢測(cè)骨骼肌氨基酸譜，熒光法檢測(cè)類糜蛋白酶活性。結(jié)果：有氧訓(xùn)練與補(bǔ)充5%劑量亮氨酸未顯著影響小鼠體重與采食量。但蛋白總量、肌原纖維與肌漿蛋白濃度、mTORSer2448、4E-BP1Thr37/46與p70S6KThr389磷酸化率及MHCⅡ蛋白表達(dá)顯著升高，Ubiquitin、Atrogin-1與MuRF-1蛋白表達(dá)以及血清促炎因子則均顯著下降。此外，單純補(bǔ)充亮氨酸導(dǎo)致了類糜蛋白酶活性的顯著下降，以及骨骼肌亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸含量的增加，有氧訓(xùn)練未產(chǎn)生類似影響。較單純有氧訓(xùn)練與補(bǔ)充亮氨酸而言，聯(lián)合干預(yù)可產(chǎn)生更為顯著的效果。結(jié)論：中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練聯(lián)合補(bǔ)充5%亮氨酸可促進(jìn)增齡小鼠在餐后狀態(tài)的骨骼肌蛋白質(zhì)合成，抑制降解，具有防治Sarcopenia的重要潛力，其機(jī)制可能與其對(duì)mTOR-p70S6K/4E-BP1途徑功能表達(dá)的上調(diào)以及對(duì)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活性的下調(diào)有關(guān)。

有氧訓(xùn)練；亮氨酸；骨骼肌；衰老；蛋白質(zhì)合成；蛋白質(zhì)降解

骨骼肌萎縮可由慢性炎癥反應(yīng)、攝食量下降或體力活動(dòng)不足等多種因素所誘發(fā)，但蛋白質(zhì)平衡紊亂才是導(dǎo)致骨骼肌萎縮的直接原因[20]，可能是蛋白質(zhì)合成率下降、降解率升高或兩者共同作用的結(jié)果[10,17]。就衰老性骨骼肌萎縮（Sarcopenia，SP）而言，其發(fā)生與發(fā)展主要由于蛋白質(zhì)合成減少所致，蛋白質(zhì)降解增多在其中亦有貢獻(xiàn)：衰老骨骼肌質(zhì)量的維持主要由基礎(chǔ)（basal）和餐后（post-prandial）肌肉蛋白質(zhì)合成（muscle protein synthesis，MPS）與降解（muscle protein breakdown，MPB）所調(diào)節(jié)，其中餐后刺激則是調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量最為重要的因素。

目前臨床對(duì)于SP的治療仍無明確標(biāo)準(zhǔn)與指引，現(xiàn)有藥物及干預(yù)手段亦未能有效應(yīng)對(duì)其發(fā)生與發(fā)展[22]。為此，近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者逐漸意識(shí)到其防治應(yīng)考慮患者的“合成抵抗”（即餐后MPS下降）特點(diǎn)，并認(rèn)為以囊括運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)及藥物等兩種或3種手段的多模式干預(yù)方式（multimodal treatment），共同對(duì)抗SP及其繼發(fā)的不良影響可能具有較好效果[2,13]。其中，運(yùn)動(dòng)聯(lián)合營(yíng)養(yǎng)支持的非藥物干預(yù)模式倍受關(guān)注，但相關(guān)研究方興未艾[6]，目前尚無公認(rèn)干預(yù)策略，作用機(jī)理亦不清楚[7]。我們前期的研究表明，有氧訓(xùn)練和/或5%亮氨酸均能夠刺激衰老骨骼肌在基礎(chǔ)狀態(tài)下的蛋白質(zhì)合成，削弱蛋白質(zhì)降解，抑制萎縮性病變，具有一定的抗SP潛力[2,3]。相比之下，有氧訓(xùn)練聯(lián)合亮氨酸的作用更為顯著[29]，佐證了多模式干預(yù)的優(yōu)勢(shì)，但其對(duì)餐后狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的影響則仍不清楚。本研究擬測(cè)定自然增齡小鼠骨骼肌內(nèi)反映蛋白質(zhì)合成代謝水平的肌原纖維蛋白質(zhì)、肌漿蛋白質(zhì)及游離氨基酸含量；檢測(cè)蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p70核糖體蛋白S6 激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4E-BP1）及與反映骨骼肌快肌質(zhì)量的肌球蛋白重鏈Ⅱ（Myosin heavy chain Ⅱ，MHCⅡ）表達(dá)；測(cè)定骨骼肌類糜蛋白酶活性、E3泛素連接酶肌萎縮蛋白Fbox-1（Muscle atrophy F-box，也稱Atrogin-1）與肌肉環(huán)指蛋白-1（Muscle ring finger protein-1，MuRF-1）等蛋白質(zhì)降解關(guān)鍵蛋白的表達(dá)以及血清促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6與IL-1β含量，從蛋白質(zhì)代謝平衡過程中合成與降解兩個(gè)途徑的變化，系統(tǒng)探討有氧訓(xùn)練聯(lián)合膳食補(bǔ)充亮氨酸對(duì)衰老所致骨骼肌萎縮的保護(hù)作用及其可能性機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性CD-1?小鼠32只，13月齡，體重48.5±0.5 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（川）2008-24。單籠飼養(yǎng)，自由攝水、進(jìn)食。每周更換墊料3次，每日清洗消毒飲水瓶，室內(nèi)照明控制為12 h，室溫20±2 ℃，濕度50%～55%。采用區(qū)間分組法根據(jù)體重將小鼠隨機(jī)納入安靜對(duì)照組（Sed組）、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組（Tra組）、補(bǔ)充亮氨酸組（LeuS組）和補(bǔ)充亮氨酸+訓(xùn)練組（LeuT組）4個(gè)處理組，普通國(guó)標(biāo)維持飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。各組小鼠每日稱量體重與采食量。

1.2 飼料配置

飼料配制方法與我們的前期報(bào)道相同：以普通國(guó)標(biāo)飼料為基礎(chǔ)，在LeuS與LeuT兩處理組小鼠飼料內(nèi)添加5%劑量亮氨酸，對(duì)照Sed與Tra組小鼠飼料中則添加3.4%劑量不影響骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的非必需氨基酸丙氨酸[2,3]，配為等氮對(duì)照飼料，以消除不同飼料粗蛋白含量差異可能對(duì)結(jié)果造成的潛在影響。亮氨酸飼料的消化能、粗蛋白、鈣、總磷與有效磷含量分別為14.35 MJ/kg、21.2%(w/w)、1.32%(w/w)、1.17%(w/w)與0.96%(w/w)。對(duì)照飼料的消化能、粗蛋白、鈣、總磷與有效磷含量分別為14.22 MJ/kg、21.8%(w/w)、1.35%(w/w)、1.19%(w/w)與0.93%(w/w)。各組飼料的氨基酸含量參見表1。

表1 本研究小鼠飼料氨基酸含量

1.3 訓(xùn)練方案

Tra與LeuT組小鼠在體積為100×70×60 cm的玻璃水缸內(nèi)進(jìn)行游泳訓(xùn)練，水溫30±2 ℃，水深約40 cm以使小鼠無法通過尾尖支撐缸底而休息。訓(xùn)練時(shí)在小鼠尾根綁縛3%比例體重的鉛皮作為負(fù)荷[29]，每日訓(xùn)練45 min，每周訓(xùn)練6天（周日休息），為期8周。每日訓(xùn)練前根據(jù)小鼠體重調(diào)整鉛皮重量。專人監(jiān)控游泳情況，若小鼠在訓(xùn)練過程中出現(xiàn)漂浮或“集團(tuán)游泳”等消極運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)，則驅(qū)趕其繼續(xù)進(jìn)行游泳。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們采用便攜式乳酸分析儀在小鼠游泳過程中和結(jié)束后即刻采集尾尖血進(jìn)行乳酸含量分析，血乳酸水平均介于2.9～3.7 mmol/l范圍內(nèi)，提示所采用訓(xùn)練方案為典型有氧運(yùn)動(dòng)。

1.4 取材

參考Rieu研究組的設(shè)計(jì)[22]，末次訓(xùn)練后當(dāng)天24:00至次日晨6：00剝奪各組小鼠食物使其處于吸收后狀態(tài)（post-absorptive），于6:00～7:00期間各組小鼠投喂2g普通國(guó)標(biāo)維持飼料使其進(jìn)食1h。進(jìn)食后2 h（9:00），各組小鼠稱重后以0.3 ml/100 g體重劑量腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉并摘眼球取血，完整分離腓腸肌，生理鹽水沖洗后濾紙吸干并稱重，經(jīng)液氮速凍后置超低溫冰箱保存待測(cè)。其中，Tra和LeuT組小鼠的處死時(shí)點(diǎn)與末次訓(xùn)練結(jié)束間隔24 h，以減少末次游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生的急性影響。

1.5 主要儀器與試劑

主要儀器：電泳儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；Mini P-4電泳槽購(gòu)自北京凱元公司；L8800全自動(dòng)氨基酸分析儀購(gòu)自日本日立公司；LS-45熒光分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)珀金埃爾默公司；MultiSkan3酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)熱電公司。

主要試劑：亮氨酸（LB0922）與丙氨酸（AD0022）購(gòu)自上海生工；蛋白提取試劑（78510）購(gòu)自美國(guó)熱電；蛋白酶抑制劑購(gòu)自瑞士羅氏（11836153001）；Bradford蛋白定量試劑盒（P0006）購(gòu)自北京碧云天公司；Ubiquitin（Ab7780）、Atrogin-1（Ab74023）、MuRF-1（Ab172479）與MHCⅡ（Ab51263）蛋白表達(dá)一抗均購(gòu)自英國(guó)艾博抗公司；mTORSer2448（5536S、2983S）、p70S6KThr389（2708S、9234S）、4E-BP1Thr37/46（2855S、9644S）的蛋白總量與磷酸化表達(dá)一抗均購(gòu)自美國(guó)賽信通公司；HRP標(biāo)記二抗（111-035-003、115-035-003）購(gòu)自美國(guó)杰克森公司；GAPDH鼠單抗（60004-1-Ig）購(gòu)自武漢三鷹公司；ECL Plus（WBKLS0010）購(gòu)自德國(guó)密理博公司；熒光底物Suc-LLVY-AMC（AAT-13453）購(gòu)自武漢艾美捷公司；TNF-α（EM008）、IL-1β（EM001）與IL-6（EM004）ELISA試劑盒購(gòu)自上海吉泰依科賽公司；常規(guī)試劑均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心、國(guó)藥或金山試劑公司，為優(yōu)級(jí)純或分析純。

1.6 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 肌原纖維與肌漿蛋白定量

定量方法參考Koopman等[18]的報(bào)道，取待測(cè)肌樣在5%預(yù)冷緩沖液（含0.25 M蔗糖、2mM EDTA與10mM pH為7.4的Tris-HCl）中進(jìn)行勻漿，此后600×g離心20 min，收集含肌原纖維蛋白的沉降物，上清則于4℃以100,000×g轉(zhuǎn)速離心60 min分離肌漿蛋白。Bradford法分別進(jìn)行蛋白定量。蛋白含量均采用毫克蛋白/克濕肌重表示。

1.6.2 免疫印跡

蛋白表達(dá)采用免疫印跡法進(jìn)行分析，檢驗(yàn)參照我們前期報(bào)道[2,3,30]的方法進(jìn)行：取腓腸肌加入蛋白提取試劑，肌樣剪成1～2 mm3碎粒后勻漿，吸取混懸液于4℃以10,000×g離心20 min取上清。Bradford法蛋白定量后以每次上樣120μg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分裝，PBS補(bǔ)足20μl。加入5X蛋白上樣緩沖液 5μl后變性10 min。配置5%濃縮膠與15%分離膠，濃縮膠80V恒壓30～40 min，分離膠120 V恒壓，溴酚藍(lán)至板底后停止。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，恒流300 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量大小進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整：MHCⅡ轉(zhuǎn)膜時(shí)間為2.5 h，稀釋比1:3 000；mTORSer2448總量與磷酸化表達(dá)轉(zhuǎn)膜時(shí)間均為2 h，稀釋比1:1 000；P70S6KThr389總量與磷酸化表達(dá)以及Atrogin-1與MuRF-1表達(dá)的轉(zhuǎn)膜時(shí)間均為1 h，稀釋比分別為1:2000、1:500、1:1 000和1:1 000；4E-BP1Thr37/46總量與磷酸化表達(dá)以及Ubquitin表達(dá)轉(zhuǎn)膜時(shí)間均為0.5 h，稀釋比均為1:1 000。一抗和二抗（1:50 000～1:200 000）孵育后，ECL plus使目的條帶發(fā)出熒光并壓片檢測(cè)二抗信號(hào)，據(jù)熒光強(qiáng)弱調(diào)節(jié)壓片時(shí)間，據(jù)預(yù)染蛋白marker位置判斷蛋白大體位置。

1.6.3 20S蛋白酶體活性測(cè)定

20S蛋白酶體活性采用類糜蛋白酶活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，參照Hepple等[15]的方法進(jìn)行檢測(cè)：以熒光肽Suc-LLVY-AMC為作用底物。將肌樣萃取物于37℃在緩沖液（含100 mM pH 8.0 Tris-HCl、1mM DTT、5mM MgCl2、1mM Suc-LLVY-AMC、2mg/ml ovalbumin和0.07% SDS）中孵育30 min后，加入25μl 10% SDS終止反應(yīng)。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)酶活性，激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。酶活性以每微克蛋白每分鐘的熒光AU表示。

1.6.4 游離氨基酸譜定量

檢測(cè)骨骼肌游離氨基酸含量時(shí)，肌樣于65 ℃烘干后研碎，乙醚脫脂24 h。脫脂肌樣置于水解管內(nèi)，加入6 mol/l鹽酸后抽真空并封管，110 ℃烘箱內(nèi)水解24 h。過濾定容后取全量消化液至干燥箱60 ℃真空揮干，加入200μl超純水后再真空揮干，重復(fù)2次。0.02 mol/l鹽酸溶解后過濾膜進(jìn)樣分析。色譜條件同我們的前期報(bào)道[2,3,30]。

1.6.5 炎性細(xì)胞因子定量

所采集血樣常規(guī)分離血清后，采用ELISA法進(jìn)行TNF-α、IL-1β與IL-6定量分析。檢測(cè)時(shí)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，450 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，570 nm為參比波長(zhǎng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體重與采食量

各時(shí)點(diǎn)體重的重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果表明，各組小鼠體重?zé)o隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，在干預(yù)期內(nèi)均較為穩(wěn)定（=2.262，=0.068）；分組因素即不同處理對(duì)小鼠體重具有影響，各處理組小鼠體重總體而言并不相同（=7.970，=0.001）。對(duì)小鼠各時(shí)點(diǎn)體重與初始體重的縱向多重比較發(fā)現(xiàn)，僅Sed組小鼠在第2周（=0.007）、第5周（=0.026）和處死前（=0.031）體重變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。

就各組小鼠平均采食量而言，重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，平均采食量具有隨時(shí)間而變化的趨勢(shì)（=6.128，=0.000）；不同處理并未產(chǎn)生顯著影響，各組平均采食量總體相同（=2.007，=0.136）（圖1B）。此外，對(duì)總采食量進(jìn)行組間多重比較，亦未見具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（圖1C）。

圖1 有氧訓(xùn)練和/或補(bǔ)充亮氨酸對(duì)小鼠體重（A）、平均采食量（B）和總采食量（C）的影響示意圖

Figure 1 Effect of Aerobic Training and/or Leucine Supplementation on Body Weight (A), Average Daily (B) and Total Food Intake (C) of Mice (n=8)

注：@:＜0.05 vs Initial;@@:＜0.01 vs Initial.

2.2 肌原纖維、肌漿蛋白含量及蛋白質(zhì)總量

與Sed組小鼠相比，8周亮氨酸補(bǔ)充使腓腸肌蛋白總量增加6.2%（=0.049），肌漿蛋白含量增長(zhǎng)26.3%（=0.003）；有氧訓(xùn)練使蛋白總量增加7.3%（=0.023），肌漿蛋白增長(zhǎng)8.4%（=0.008）；聯(lián)合干預(yù)則導(dǎo)致蛋白總量增加27.1%（=0.000），肌漿蛋白增加達(dá)36.9%（=0.000），提示，運(yùn)動(dòng)與氨基酸兩因素具有協(xié)同促進(jìn)效應(yīng)（圖2A、2C）。

如圖2B所示，較Sed組小鼠而言，LeuS組肌原纖維蛋白含量增長(zhǎng)13.9%（=0.032），Tra組增長(zhǎng)19.3%（=0.004），LeuT組則增加達(dá)44.5%（=0.000），且LeuT組各指標(biāo)與LeuS、Tra組小鼠相比，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.000）。

2.3 類糜蛋白酶活性

如圖3所示，較Sed組而言，LeuS組小鼠骨骼肌類糜蛋白酶活性下降9.9%（=0.029），LeuT組則降低達(dá)38.4%（=0.000），組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且LeuT組各指標(biāo)與LeuS和Tra組小鼠相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.000）。

圖2 有氧訓(xùn)練和/或補(bǔ)充亮氨酸對(duì)腓腸肌蛋白總量（A）、肌原纖維（B）與肌漿蛋白（C）含量的影響示意圖

Figure 2 Effect of Aerobic Training and/or Leucine Supplementation on Total Protein (A), Myofibrillar (B) and Sarcoplasmic (C) Protein of Mice (n=8)

注：*:＜0.05 vs Sed,**:＜0.01 vs Sed;##:＜0.01 vs LeuS;&&:＜0.01 vs Tra.

2.4 骨骼肌游離氨基酸

如圖4所示，各處理組之間僅亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸與丙氨酸含量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它游離氨基酸未見顯著的組間差異。就均值水平而言，LeuS與LeuT組小鼠游離亮氨酸（＜0.01）、異亮氨酸（＜0.01）與纈氨酸（＜0.01）均較Sed與Tra組為高，而丙氨酸（＜0.01）水平則較低。

2.5 血清炎性細(xì)胞因子含量

如圖5A、5B所示，LeuS組血清TNF-α含量較Sed組小鼠下降6.4%（=0.037），IL-6下降11.8%（=0.038）；Tra組TNF-α含量下降6.2%（=0.045），IL-6下降12.5%（=0.038）；而LeuT組TNF-α則下降達(dá)21.3%（=0.000），IL-6含量下降40.5%（=0.000），組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。就TNF-α而言，LeuT組較LeuS（=0.000）與Tra（=0.000）組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-6亦表現(xiàn)出了同樣的組間趨勢(shì)。

如圖5C，與Sed組小鼠相比，LeuS組IL-1β含量下降17.1%（=0.039），Tra組下降17.6%（=0.034），而LeuT組則下降40.1%（=0.000）。且LeuT組較Tra（=0.008）與LeuS組（=0.007）差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 有氧訓(xùn)練和/或補(bǔ)充亮氨酸對(duì)類糜蛋白酶活性的影響示意圖

Figure 3 Effect of Aerobic Training and/or Leucine Supplementation on Chymotrypsin-like Enzyme Activity (n=8)

注：*:＜0.05 vs Sed,**:＜0.01 vs Sed;##:＜0.01 vs LeuS;&&:＜0.01 vs Tra.

圖4 本研究有氧訓(xùn)練和/或補(bǔ)充亮氨酸對(duì)骨骼肌游離必需（A）與非必需（B）氨基酸的影響示意圖

Figure 4 Effect of Aerobic Training and/or Leucine Supplementation on Free Essential (A) and Nonessential (B) Amino Acids in Skeletal muscle (n=8)

注：**:＜0.01 vs Sed;##:＜0.01 vs LeuS;&&:＜0.01 vs Tra,&&:＜0.01 vs Tra. Leu:亮氨酸，Ile：異亮氨酸，Val：纈氨酸，Ala：丙氨酸.

圖5 有氧訓(xùn)練和/或補(bǔ)充亮氨酸對(duì)血清TNF-α（A）、IL-6（B）與IL-1β（C）含量的影響示意圖

注：*:＜0.05 vs Sed,**:＜0.01 vs Sed;##:＜0.01 vs LeuS;&&:＜0.01 vs Tra.

圖6 有氧訓(xùn)練和/或補(bǔ)充亮氨酸對(duì)蛋白質(zhì)合成與降解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響示意圖

Figure 6 Effect of Aerobic Training and/or Leucine Supplementation on the Expression of Protein in Connection with Protein Synthesis and Degradation (n=8)

注：*:＜0.05 vs Sed,**:＜0.01 vs Sed;#:＜0.05 vs LeuS,##:＜0.01 vs LeuS;&:＜0.05 vs Tra,&&:＜0.01 vs Tra.

2.6 蛋白表達(dá)

經(jīng)8周不同處理，各組小鼠腓腸肌內(nèi)與骨骼肌蛋白質(zhì)合成及降解相關(guān)的蛋白/磷酸化表達(dá)水平如圖6所示。就蛋白質(zhì)降解相關(guān)蛋白Ubiquitin、Atrogin-1與MuRF-1表達(dá)而言：Tra、LeuS與LeuT組小鼠較Sed組表達(dá)水平均下調(diào)（＜0.01），而LeuS與LeuT組表達(dá)則較Tra為低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05或＜0.01）。MHCⅡ表達(dá)的組間差異趨勢(shì)與Ubiquitin等降解相關(guān)蛋白相反，各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)較Sed組均顯著上調(diào)（＜0.01），LeuT組較Tra（=0.047）與LeuS（=0.003）組表達(dá)為高，且差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6B）。與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的mTORSer2448、p70S6KThr389與4E-BP1Thr37/46磷酸化率如圖6C所示，各蛋白組間多重比較結(jié)果均與MHCⅡ一致。

3 分析與討論

本研究以規(guī)律有氧訓(xùn)練聯(lián)合補(bǔ)充亮氨酸的多模式干預(yù)方式，從對(duì)衰老骨骼肌餐后蛋白質(zhì)代謝平衡的調(diào)節(jié)出發(fā)，探討了非藥物干預(yù)途徑在防治衰老性SP過程中可能存在的重要潛力，佐證了運(yùn)動(dòng)聯(lián)合蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)在衰老性SP臨床干預(yù)中的重要作用，可為臨床干預(yù)手段的開發(fā)提供一定的理論線索。

3.1 有氧訓(xùn)練與補(bǔ)充亮氨酸對(duì)衰老小鼠體重與采食量影響

本研究發(fā)現(xiàn)，有氧訓(xùn)練和/或補(bǔ)充亮氨酸并未顯著影響衰老小鼠的采食量，生長(zhǎng)性能亦表現(xiàn)正常。統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重、采食量往往與稱量時(shí)間及動(dòng)物的末次進(jìn)食時(shí)間等因素相關(guān)聯(lián)，循前期研究經(jīng)驗(yàn)，本研究通過如下手段有效控制了這些混雜因素可能造成的影響：1）固定稱量時(shí)間。在食物充足的情況下，小鼠的采食習(xí)性亦會(huì)形成規(guī)律，通過固定每日稱量體重與采食量的時(shí)間，可在一定程度上降低總體采樣誤差；2）減少磨牙損耗。嚙齒類動(dòng)物具有磨牙習(xí)性，易對(duì)顆粒飼料造成損耗，從而直接影響采食量計(jì)算的準(zhǔn)確性。通過在鼠籠內(nèi)放置椴木塊使小鼠用于磨牙，可有效減少其對(duì)采食量造成的影響；3）控制飼料配方變化。飼料配方的變化可顯著影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重與采食量，這一現(xiàn)象多見于飼喂高脂高糖飼料初期或其它配方具有顯著改變的情況下。本研究以國(guó)標(biāo)維持飼料為底料，僅分別進(jìn)行了5%（亮氨酸）和3.4%（等氮丙氨酸）比例的玉米粉替換，從而較好的保持了實(shí)驗(yàn)小鼠習(xí)慣的飼料配方；4）應(yīng)用平均采食量指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。采食量的變化與代謝體重（W0.75）正性相關(guān)[19]，通過體重對(duì)其采食量進(jìn)行校正，而得出的平均采食量指標(biāo)，則可有效規(guī)避小鼠每日體重變化對(duì)結(jié)果所產(chǎn)生的影響。此外，所施加的運(yùn)動(dòng)干預(yù)手段由于強(qiáng)度較低（血乳酸2.9～3.7 mmol/l），因此未對(duì)運(yùn)動(dòng)組小鼠的體重與采食量造成顯著影響。而小鼠代謝體重的波動(dòng)變化以及隨意采食量本身時(shí)多時(shí)少的特點(diǎn)，亦可能是采食總量未見顯著差異的原因[3]。

3.2 有氧訓(xùn)練與補(bǔ)充亮氨酸對(duì)衰老小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成與降解的影響

蛋白質(zhì)平衡紊亂是導(dǎo)致骨骼肌萎縮的根本原因[4,21]，可能是蛋白質(zhì)合成率下降、降解率升高或兩者共同作用的結(jié)果[10,17]。SP骨骼肌蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)機(jī)制以mTORC1復(fù)合物為中心，其中，mTOR-p70S6K/4E-BP1信號(hào)通路的活化被視為蛋白質(zhì)合成促進(jìn)的間接指示。隨著SP進(jìn)程的發(fā)展，mTOR及p70S6K/4E-BP1功能表達(dá)在基礎(chǔ)狀態(tài)和/或餐后狀態(tài)呈下調(diào)趨勢(shì)，從而較健康機(jī)體出現(xiàn)蛋白質(zhì)合成減少，并最終表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量與機(jī)能的下降。在本研究中我們觀察到，與安靜對(duì)照小鼠相比，各干預(yù)組小鼠骨骼肌mTORSer2448、p70S6KThr389與4EBP1Thr37/46磷酸化表達(dá)均有顯著上調(diào)，結(jié)合骨骼肌蛋白質(zhì)總量及肌原纖維和肌漿蛋白含量的變化，說明各組小鼠的MPS均有明顯增加。此外，衰老性骨骼肌萎縮變化主要發(fā)生于快縮型骨骼肌，而骨骼肌收縮表型及纖維類型由肌球蛋白重鏈MHC亞型I、Ⅱa和Ⅱx的相對(duì)表達(dá)所決定[8]，因此，腓腸肌MHCⅡ表達(dá)的變化亦在一定程度上反映了MPS水平的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，所施加干預(yù)誘使衰老小鼠腓腸肌MHC II表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步佐證了有氧訓(xùn)練和/或亮氨酸的促M(fèi)PS潛力。就SP骨骼肌蛋白質(zhì)降解機(jī)制而言，炎性介質(zhì)活化的泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-Proteasome System，UPS）是主要水解系統(tǒng)[24]。目前，已知兩種被稱為Atrogenes的肌肉特異性E3泛素連接酶MuRF1和Atrogin-1直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成抑制和骨骼肌分解[24]。當(dāng)骨骼肌蛋白質(zhì)降解超過合成，亦會(huì)表現(xiàn)為骨骼肌萎縮與機(jī)能衰退。本研究結(jié)果顯示，各干預(yù)組小鼠骨骼肌Ubiquitin、Atrogin-1和MuRF-1表達(dá)均明顯下調(diào)。由此可見，規(guī)律有氧訓(xùn)練與膳食補(bǔ)充亮氨酸均具有促進(jìn)衰老機(jī)體MPS和抑制MPB的功能。但需要強(qiáng)調(diào)的是，通過對(duì)各處理組的干預(yù)效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，由于有氧訓(xùn)練組小鼠腓腸肌Ubiquitin、Atrogin-1及MuRF-1表達(dá)水平均高于膳食補(bǔ)充亮氨酸組（＜0.01），且類糜蛋白酶活性較安靜對(duì)照小鼠并無差異，從而提示，所施加8周有氧訓(xùn)練干預(yù)的作用主要在于對(duì)MPS的促進(jìn)而非抑制MPB。而膳食補(bǔ)充亮氨酸雖然產(chǎn)生了與有氧訓(xùn)練類似的促M(fèi)PS效應(yīng)，但其對(duì)MPB的抑制作用則更為顯著。因此，有氧訓(xùn)練聯(lián)合補(bǔ)充亮氨酸組（LeuT）小鼠所表現(xiàn)出的改善衰老骨骼肌蛋白質(zhì)平衡作用究竟主要由何種因素所致（有氧訓(xùn)練 vs 亮氨酸）？其作用究竟是側(cè)重于促進(jìn)MPS還是抑制MPB？目前均不清楚，仍有待深入研究予以澄清。

3.3 有氧訓(xùn)練與膳食補(bǔ)充亮氨酸對(duì)衰老小鼠骨骼肌游離氨基酸的影響

作為蛋白質(zhì)合成前體，游離氨基酸含量直接影響MPS與MPB之間的平衡，從而對(duì)于衰老骨骼肌質(zhì)量與功能的維持具有重要意義。迄今，鮮見運(yùn)動(dòng)與補(bǔ)充亮氨酸對(duì)骨骼肌游離氨基酸譜影響的相關(guān)報(bào)道。有零星文獻(xiàn)線索提示，在燒傷、極度饑餓等極端情況下，MPB和氨基酸釋放增多而用于緩沖血漿氨基酸水平的變化，此時(shí)骨骼肌作為“氨基酸池”在骨骼肌量的維持方面發(fā)揮著重要作用[28]，而適度的運(yùn)動(dòng)則可能削弱MPB與骨骼肌氨基酸的釋放[9]。本研究中觀察到，8周干預(yù)僅導(dǎo)致衰老小鼠骨骼肌游離亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸與丙氨酸含量出現(xiàn)顯著的組間差異。與安靜對(duì)照小鼠相比，運(yùn)動(dòng)未顯著改變各種游離氨基酸水平；補(bǔ)充亮氨酸導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)游離亮氨酸儲(chǔ)量增加，纈氨酸、異亮氨酸與丙氨酸水平則均明顯較低，且運(yùn)動(dòng)聯(lián)合亮氨酸組小鼠亦觀察到了相同趨勢(shì)。本研究取材時(shí)點(diǎn)為餐后2 h，此時(shí)骨骼肌分解代謝并不旺盛，骨骼肌內(nèi)游離氨基酸含量亦較為穩(wěn)定，可能掩蓋了長(zhǎng)期訓(xùn)練所導(dǎo)致的氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)變化。而由于各組飼料本身亮氨酸與丙氨酸含量的差異，骨骼肌游離亮氨酸與丙氨酸含量的差異亦成為必然。然而需要指出的是：一方面，運(yùn)動(dòng)聯(lián)合補(bǔ)充亮氨酸組小鼠較其它各組而言，僅觀察到了游離亮氨酸水平的顯著優(yōu)勢(shì)，結(jié)合本研究中蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路蛋白與Atrogenes功能表達(dá)變化考慮，這一結(jié)果極大程度上佐證了亮氨酸在調(diào)節(jié)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成方面的重要作用，與前人的研究結(jié)果與觀點(diǎn)亦保持了一致[5]；另一方面，補(bǔ)充亮氨酸組（LeuS）與運(yùn)動(dòng)聯(lián)合補(bǔ)充亮氨酸組（LeuT）小鼠所表現(xiàn)出的較低纈氨酸與異亮氨酸水平是一個(gè)有趣的現(xiàn)象。Rieu研究組此前關(guān)于血清氨基酸的檢測(cè)結(jié)果亦觀察到了這一變化[23]，但迄今仍未明確這一現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)理。該組其后的研究在補(bǔ)充亮氨酸時(shí)往往同時(shí)額外添加纈氨酸與異亮氨酸以削弱這一改變，但筆者認(rèn)為，纈氨酸與異亮氨酸作為重要的必需氨基酸，與亮氨酸同時(shí)添加時(shí)很可能會(huì)對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生混雜影響，從而掩蓋亮氨酸的真正作用。可見，補(bǔ)充亮氨酸為何會(huì)導(dǎo)致血漿與骨骼肌內(nèi)另外兩種游離支鏈氨基酸含量下降，仍是有待探索的問題。

3.4 有氧訓(xùn)練與膳食補(bǔ)充亮氨酸改善衰老骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的可能性機(jī)制

運(yùn)動(dòng)以及亮氨酸促進(jìn)衰老骨骼肌MPS并抑制MPB的確切分子機(jī)制迄今仍不清楚，但近期的證據(jù)表明，其似乎與炎癥相關(guān)。促炎因子，尤其是TNF-α和IL-6可能在其中具有重要作用[25]。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，尤其是規(guī)律地有氧訓(xùn)練對(duì)于低水平、全身性炎癥的抑制可能具有重要作用[12]，當(dāng)前觀點(diǎn)認(rèn)為，有氧訓(xùn)練可降低腹部、四肢脂肪及循環(huán)促炎細(xì)胞因子的生成與集聚[11]。本研究中我們觀察到小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量在8周有氧干預(yù)后出現(xiàn)了顯著下降（＜0.05），佐證了規(guī)律有氧訓(xùn)練的抑炎作用。單純補(bǔ)充亮氨酸組小鼠亦觀察到了類似的結(jié)果，亮氨酸對(duì)衰老骨骼肌炎性細(xì)胞因子含量的影響目前未見相關(guān)報(bào)道，但近期有研究表明，高脂/膽固醇膳食導(dǎo)致小鼠血清IL-6與TNF-α水平增高（＜0.01），而補(bǔ)充1.5%和3%劑量亮氨酸均可逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)，且后者效果更為顯著[16]。Giri等此前的研究亦顯示，補(bǔ)充亮氨酸可抑制脂多糖誘發(fā)的炎性反應(yīng)，顯著降低血清TNF-α與IL-1β含量，且具有顯著的正性量-效關(guān)系（100～350μg/ml劑量范圍）[14]。此外，亮氨酸亦被認(rèn)為可以改善食欲，進(jìn)而減少M(fèi)PB，且聯(lián)合運(yùn)動(dòng)時(shí)可誘發(fā)協(xié)同的促進(jìn)MPS反應(yīng)[29,30]。本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)與補(bǔ)充亮氨酸通過協(xié)同促進(jìn)作用，更為顯著的抑制了TNF-α與IL-6血清水平，盡管IL-1β未見顯著交互，但其均值水平仍顯著低于LeuS與Tra組小鼠。Torres-Leal給高脂膳食大鼠施加5%亮氨酸和/或有氧訓(xùn)練干預(yù)（負(fù)荷5%自體重，60 min/天，5次/周，共計(jì)6周），檢測(cè)TNF-α含量，亦觀察到了與本研究一致的結(jié)果[26]。由此可見，有氧運(yùn)動(dòng)與補(bǔ)充亮氨酸均可產(chǎn)生抑炎效應(yīng)，且聯(lián)合干預(yù)效果更為顯著。

目前，關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合補(bǔ)充亮氨酸對(duì)SP干預(yù)的相關(guān)研究仍然極為匱乏。但是，鑒于前述蛋白質(zhì)含量、合成與降解相關(guān)通路蛋白的表達(dá)變化，以及我們此前的相關(guān)研究結(jié)果[2-4]，有理由相信，采用有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合亮氨酸膳食補(bǔ)充可削弱炎癥，逆轉(zhuǎn)負(fù)性骨骼肌蛋白質(zhì)平衡，并最終改善衰老導(dǎo)致的骨骼肌萎縮[27]。有氧訓(xùn)練與亮氨酸交互作用于炎性反應(yīng)并進(jìn)而改善骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的潛在機(jī)制如圖7所示。

圖7 有氧訓(xùn)練和/或補(bǔ)充亮氨酸經(jīng)調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)代謝改善SP的機(jī)制

Figure 7 Mechanism of Aerobic Training and/or Leucine Supplementation Alleviating Sarcopenia Via the Regulation of Protein Metabolism in Skeletal Muscle

4 結(jié)論

3%自體重負(fù)荷的中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練以及5%劑量亮氨酸膳食補(bǔ)充均能夠促進(jìn)增齡小鼠腓腸肌蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)降解，且聯(lián)合干預(yù)時(shí)效果更為明顯，具有防治衰老性骨骼肌萎縮的重要潛力。究其機(jī)理，可能與有氧訓(xùn)練和亮氨酸均能發(fā)揮抑炎效應(yīng)，進(jìn)而上調(diào)mTOR-p70S6K/4E-BP1途徑功能表達(dá)促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，并經(jīng)下調(diào)UPS系統(tǒng)活性而抑制蛋白質(zhì)降解有關(guān)。

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Effects of Aerobic Training in Combination with Leucine Supplementation on Protein Metabolism in Skeletal Muscle of Pre-Senescent Mice

XIA Zhi1, ZHAO Yan1, SHANG Hua-yu2, YANG Li-yuan3, FU Yu2, SUN Jun-zhi2, SU Quan-sheng2

1. Jinggangshan University, Ji’an 343009, China; 2. Chengdu Sport Institute, Chengdu 610041,China;3. Chengdu University, Chengdu 610106, China.

Objective: To investigate the effect and mechanism of aerobic training in combination with leucine supplementation on muscle protein synthesis and protein degradation. Methods: Thirteen-month-old male CD-1? mice were randomly divided into sedentary control, aerobic training control, dietary leucine supplementation, and aerobic training in combination with leucine supplementation. Leucine was supplemented with 5% dosage. Mice in training group received 45 min swimming training with 3% body weight workload for 8 weeks (6 days/wk). Protein content were measured with Bradford kit. The expression and phosphorylation rate of protein were determined by using Western blotting. The concentration of serum inflammatory cytokines were measured with ELISA kit. The profile of free amino acids in muscle was detected with an amino acids analyzer. The activity of chymotrypsin-like enzyme was determined by using fluorescence method. Results: Both aerobic training and 5% leucine supplementation did not change the body weight, and food intake. Myofibrillar, sarcoplasmic and total protein content, the phosphorylation rate of mTORSer2448, 4E-BP1Thr37/46, p70S6KThr389 and the expression of MHCⅡ were significantly elevated, while the expression of Ubiquitin, Atrogin-1 and MuRF-1, and the concentration of pro-inflammatory cytokines in serum were decreased obviously. Besides, leucine supplementation induced a significant decrease of chymotrypsin-like enzyme activity, and increases of leucine, isoleucine and valine in skeletal muscle. The combination of aerobic training and leucine supplementation leaded more significant effects when in comparison with training or leucine supplementation alone. Conclusion: Moderate aerobic training in combination with 5% leucine supplementation promotes post-prandial protein synthesis in skeletal muscle of pre-senescent mice, and inhibits protein degradation, which may be correlated with elevated functional expression of mTOR-p70S6K/4E-BP1 pathway and decreased activity of ubiquitin-proteasome system.

1000-677X(2018)03-0057-10

10.16469/j.css.201803007

G804.7

A

2017-05-10；

2018-03-03

江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ160738);井岡山大學(xué)博士科研基金(JZB15014);江西省高校人文社科項(xiàng)目(TY17210).

夏志,男,副教授,博士,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理學(xué),E-mail: xiazhi1982@163.com。