周景儒，王棟梁，劉志，武廣永， 劉如恩

(北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京100044)

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，源于神經(jīng)上皮組織，患者預(yù)后較差。微小RNA(miRNA)屬于非編碼RNA，是長(zhǎng)度19～25個(gè)核苷酸的小RNA分子，其序列具有高度保守性[1～3]。研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織中存在多種 miRNA異常表達(dá)[4,5]。本研究觀察了miR-720和miR-29c在腦膠質(zhì)瘤患者血清中的表達(dá)變化，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2013年1月～2017年1月我院收治的腦膠質(zhì)瘤患者87例(膠質(zhì)瘤組)，男54例、女33例，年齡37～68(48±9)歲；星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤27例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤32例，少突星形細(xì)胞瘤28例；Ⅰ～Ⅱ級(jí)58例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)29例；腫瘤位于額葉32例、顳葉21例、其他部位16例，腫瘤位于多個(gè)腦葉18例。納入標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)切除腫瘤，術(shù)后經(jīng)病理診斷證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤；術(shù)前未接受放療、化療；臨床病理資料完整；完成12個(gè)月的隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；合并慢性疾病(如冠心病、高血壓、糖尿病等)；合并感染性疾病。選擇同期體檢健康者50例為對(duì)照組，男32例、女18例，年齡33～70(52±12)歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2血清miR-720和miR-29c表達(dá)檢測(cè)分別采集膠質(zhì)瘤組手術(shù)前后及對(duì)照組清晨空腹肘靜脈血10 mL，3 000 r/min離心10 min，收集血清。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清miR-720和miR-29c表達(dá)。具體步驟：取血清樣本，采用mirVanaTMPARISTM試劑盒(Ambion-560)提取血清總RNA，超微量核酸蛋白測(cè)定儀(ND-2000)檢測(cè)RNA濃度及純度，DNAase Ⅰ酶去除DNA，TaqMan microRNA RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。引物及探針序列：hsa-miR-720：UCUCGCUGGGGCCUCCA；hsa-miR-29c：TAACCGA-

TTTCAAATGGTGCTA。目標(biāo)基因探針和內(nèi)參基因探針均為5′端采用FAM報(bào)告熒光標(biāo)記，3′端采用TAMRA淬滅熒光標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系：4.5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，0.5 μL TaqMan microRNA assay (5×)，5.0 μL TaqMan Mix。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCt法)計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。分別以血清miR-720、miR-29c相對(duì)表達(dá)量的平均值為界限，≥平均值為高表達(dá)，<平均值為低表達(dá)。分析血清miR-720、miR-29c表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

2　結(jié)果

2.1兩組血清miR-720、miR-29c表達(dá)比較膠質(zhì)瘤組術(shù)前、術(shù)后血清miR-720相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，血清miR-29c相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組。膠質(zhì)瘤組術(shù)后血清miR-720相對(duì)表達(dá)量低于術(shù)前，miR-29c相對(duì)表達(dá)量高于術(shù)前；組間及組內(nèi)比較P均<0.05。見(jiàn)表1。膠質(zhì)瘤組miR-720高表達(dá)者47例、低表達(dá)者40例，miR-29c高表達(dá)者42例、低表達(dá)者45例。

2.2血清miR-720、miR-29c表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系腦膠質(zhì)瘤患者血清miR-720表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，即分化水平越高，血清miR-720相對(duì)表達(dá)量越低(P<0.05)；血清miR-29c表達(dá)與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，即分化水平越高，血清miR-29c相對(duì)表達(dá)量越高(P<0.05)；血清miR-720、miR-29c表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理類型、腫瘤位置、KPS評(píng)分均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表1　兩組血清miR-720、miR-29c相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與同組術(shù)前比較，△P<0.05。

表2　　　　血清miR-720、miR-29c表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3血清miR-720、miR-29c表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系觀察組miR-720高表達(dá)者與低表達(dá)者1年生存率分別為74.37%、92.50%，二者比較χ2=4.924、P=0.026。miR-29c高表達(dá)者與低表達(dá)者1年生存率分別為92.86%、73.33%，二者比較χ2=5.803、P=0.016。

3　討論

腦膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、通常與正常腦組織無(wú)明顯界限，導(dǎo)致常規(guī)影像學(xué)、血常規(guī)等檢查手段不能精準(zhǔn)地進(jìn)行診斷和評(píng)估病情[6]。

miRNA可與靶基因信使RNA(mRNA)的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)特異性結(jié)合，抑制蛋白翻譯，從而參與細(xì)胞分化、增殖等生物過(guò)程。研究證實(shí)，在腦膠質(zhì)瘤中存在多種miRNA異常表達(dá)[7]，如miR-137可靶向EZH2基因，參與腦膠質(zhì)瘤的增殖和血管形成[8，9]。miR-720不是經(jīng)典的miRNA，很可能是一種來(lái)源于轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)的miRNA[9]。在正常生理狀態(tài)下，miR-720在內(nèi)皮生長(zhǎng)和牙髓細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮作用[10]。研究證實(shí)，miR-720在人類腫瘤中表達(dá)異常，如在宮頸癌中miR-720表達(dá)顯著增加，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[11]；血清miR-720可以作為人結(jié)腸癌[12]和骨髓瘤[13]的血清標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組血清miR-720水平顯著高于對(duì)照組，術(shù)后血清miR-720水平較術(shù)前降低，且血清miR-720水平與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，miR-720高表達(dá)患者的近期預(yù)后較差；提示miR-720高表達(dá)參與并促進(jìn)了腦膠質(zhì)瘤的腫瘤形成和惡性進(jìn)展過(guò)程，miR-720可以作為評(píng)估腦膠質(zhì)瘤惡性程度及患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。Li等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-720在乳腺癌中表達(dá)降低，且其低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后有明顯的相關(guān)性；與本研究在腦膠質(zhì)瘤中的研究結(jié)果不一致?？赡茉?yàn)閙iRNA通過(guò)靶向調(diào)節(jié)不同功能的基因表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮完全不同的生物學(xué)效應(yīng)。

miR-29c是miR-29家族的重要成員，在多種腫瘤中處于低表達(dá)狀態(tài)、發(fā)揮抑癌基因的功能，如在肝細(xì)胞癌中，miR-29c靶向TNFAIP3基因，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；在膀胱癌中，miR-29c通過(guò)靶向CDK6基因，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。有研究證實(shí)，在腦膠質(zhì)瘤中miR-29c參與細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的化療敏感性[15]。Yu等[16]發(fā)現(xiàn)miR-29c在胃癌細(xì)胞表達(dá)水平較低，增加miR-29c表達(dá)可抑制NASP基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)G1/G0期阻滯。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，腦膠質(zhì)瘤組血清miR-29c水平明顯降低，術(shù)后血清miR-720水平較術(shù)前升高，且血清miR-29c水平與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，miR-29c高表達(dá)患者的近期預(yù)后較好；提示miR-29c低表達(dá)參與并促進(jìn)了腦膠質(zhì)瘤的腫瘤形成和惡性進(jìn)展過(guò)程，miR-29c可以作為評(píng)估腦膠質(zhì)瘤惡性程度、患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。

綜上所述， miR-720高表達(dá)、miR-29c低表達(dá)共同促進(jìn)了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展；血清miR-720、miR-29c具有作為腦膠質(zhì)瘤生物靶標(biāo)的潛能。

參考文獻(xiàn)：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Modrek AS, Bayin NS, Placantonakis DG. Brain stem cells as the cell of origin in glioma[J]. World J Stem Cells, 2014,6(1):43-52.

[3] Massillo C, Dalton GN, Farré PL, et al. Implications of microRNA dysregulation in the development of prostate cancer[J]. Reproduction, 2017,154(4):R81-81，R97.

[4] Jiang X, Du L, Duan W, et al. Serum microRNA expression signatures as novel noninvasive biomarkers for prediction and prognosis of muscle-invasive bladder cancer[J]. Oncotarget, 2016,7(24):36733-36742.

[5] Piwecka M, Rolle K, Belter A, et al. Comprehensive analysis of microRNA expression profile in malignant glioma tissues[J]. Mol Oncol, 2015,9(7):1324-1340.

[6] Stummer W. Fluorescein in brain metastasis and glioma surgery[J]. Acta Neurochir (Wien), 2015,157(12):2199-2200.

[7] Beischlag TV, Anderson G, Mazzoccoli G. Glioma: tryptophan catabolite and Melatoninergic pathways link microRNA, 14-3-3, chromosome 4q35, epigenetic processes and other glioma biochemical changes[J]. Curr Pharm Des, 2016,22(8):1033-1048.

[8] Bhat NS, Colden M, Dar AA, et al. MicroRNA-720 regulates E-cadherin-α E-catenin complex and promotes renal cell carcinoma[J]. Mol Cancer Ther, 2017,16(12):2840-2848.

[9] Schopman NC, Heynen S, Haasnoot J, et al. A miRNA-tRNA mix-up: tRNA origin of proposed miRNA[J]. RNA Biol, 2010,7(5):573-576.

[10] Hara ES, Ono M, Eguchi T, et al. miRNA-720 controls stem cell phenotype, proliferation and differentiation of human dental pulp cells[J]. PLoS One, 2013,8(12):e83545.

[11] Lin Y, Zeng Y, Zhang F, et al. Characterization of microRNA expression profiles and the discovery of novel microRNAs involved in cancer during human embryonic development[J]. PLoS One, 2013,8(8):e69230.

[12] Nonaka R, Miyake Y, Hata T, et al. Circulating miR-103 and miR-720 as novel serum biomarkers for patients with colorectal cancer[J]. Int J Oncol, 2015,47(3):1097-1102.

[13] Jones CI, Zabolotskaya MV, King AJ, et al. Identification of circulating microRNAs as diagnostic biomarkers for use in multiple myeloma[J]. Br J Cancer, 2012,107(12):1987-1996.

[14] Li LZ, Zhang CZ, Liu LL, et al. miR-720 inhibits tumor invasion and migration in breast cancer by targeting TWIST1[J]. Carcinogenesis, 2014,35(2):469-478.

[15] Xiao S, Yang Z, Qiu X, et al. miR-29c contribute to glioma cells temozolomide sensitivity by targeting O6-methylguanine-DNA methyltransferases indirectely[J]. Oncotarget, 2016,7(31):50229-50238.

[16] Yu B, Chen X, Li J, et al. microRNA-29c inhibits cell proliferation by targeting NASP in human gastric cancer[J]. BMC Cancer, 2017,17(1):109.