大豆分離蛋白-葡聚糖糖基化產(chǎn)物作為乳化劑和活性物質(zhì)載體的性能分析

曹 靜，翁靜宜，程 萌，齊軍茹*

乳化劑在現(xiàn)代食品工業(yè)中扮演重要的角色，在乳制品、醬汁及冰淇淋等甜品的工藝中應(yīng)用廣泛。多種蛋白質(zhì)由于其兩親性結(jié)構(gòu)和表面活性而具有良好的乳化性，蛋白吸附于油水界面阻止油滴的聚集，被視為環(huán)境友好型乳化劑。然而，蛋白的乳化活性在等電點(diǎn)或者高溫和高鹽的加工條件下大幅度降低。國(guó)內(nèi)外學(xué)者討論了美拉德反應(yīng)的方法對(duì)糖基化產(chǎn)物物化性質(zhì)的影響，如干熱、濕熱及超聲輔助等方法，以及糖基化產(chǎn)物在水包油乳化劑和作為活性物質(zhì)包封、運(yùn)輸載體方面的熱點(diǎn)應(yīng)用[1]。

多糖對(duì)蛋白的修飾在其乳化性應(yīng)用上取得巨大的成就[2-7]。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）與麥芽糊精和阿拉伯膠干熱產(chǎn)物都顯著提高了乳液的乳化穩(wěn)定性[2]；大豆乳清蛋白與葫蘆巴膠糖基化產(chǎn)物的粒徑在蛋白等電點(diǎn)和高鹽條件下顯著減小，并且證明了熱處理糖基化產(chǎn)物后（75 ℃和85 ℃）制備的乳液的性能更加穩(wěn)定[3]。近些年，花生蛋白借助其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的表面活性受到了廣泛的關(guān)注。花生蛋白與葡聚糖、麥芽糖共價(jià)接枝改善了花生蛋白在等電點(diǎn)的物化性質(zhì)。在超聲輔助條件下，不同制備參數(shù)快速得到不同接枝程度花生蛋白-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物，表面疏水性變化明顯，在乳化體系中的穩(wěn)定性提高[7]。但是其加工性能易受到環(huán)境改變的影響。

葡聚糖在溶液中呈中性，分子的主鏈結(jié)構(gòu)由α（1→6）糖苷鍵連接葡萄糖單位聚合而成，葡聚糖分子中也可能含有少量α（1→2）和α（1→4）等糖苷鍵，α（1→6）糖苷鍵增加了葡聚糖的水溶性，每個(gè)葡聚糖分子都有一個(gè)還原末端可以和氨基酸發(fā)生接枝反應(yīng)[8-11]。作為中性多糖的葡聚糖具有簡(jiǎn)單的直鏈結(jié)構(gòu)和良好的水溶性和穩(wěn)定性。此外，葡聚糖尚有清除游離基、抗輻射、溶解膽固醇，預(yù)防高脂血癥作用及抵抗濾過性病毒、真菌、細(xì)菌等引起的感染等作用，因此被廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)和多糖的糖基化研究中[12-14]。

納米技術(shù)作為包埋活性物質(zhì)的手段，能夠增強(qiáng)人體對(duì)活性物質(zhì)的吸收和起到控釋的作用，在功能性食品和藥物學(xué)領(lǐng)域中越來越受到關(guān)注。納米包埋材料來源豐富，其中天然高分子材料，如固體脂、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)和多糖，由于其不同的特性及豐富的營(yíng)養(yǎng)備受關(guān)注[15]。但是，可以廣泛獲得并且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的植物蛋白（主要是大豆蛋白）在其等電點(diǎn)的應(yīng)用受到極大限制[16]。糖基化產(chǎn)物作為克服蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)不具溶解性的綠色包埋介質(zhì)在國(guó)內(nèi)外被廣泛研究。Yang Yuexi等[17]研究了大豆蛋白-大豆多糖增強(qiáng)了含有檸檬醛的水包油乳液的物理穩(wěn)定性。Feng Jin等[18]研究了關(guān)于通過美拉德反應(yīng)制備卵白蛋白-葡聚糖納米凝膠提高姜黃素的生物利用價(jià)值，在等電點(diǎn)獲得的穩(wěn)定納米凝膠作為包封材料顯示出重要的意義。由于美拉德產(chǎn)物接枝程度不均一，是多種產(chǎn)物的混合體系，對(duì)其包埋效果產(chǎn)生一定的影響。

隨著“大分子擁擠”體系在蛋白-多糖型美拉德反應(yīng)領(lǐng)域的廣泛研究，不同程度上達(dá)到了蛋白分子處于非聚集狀態(tài)的反應(yīng)效果，顯著改善了糖基化產(chǎn)物的物化性能[19]。大分子擁擠體系產(chǎn)物在其功能上的應(yīng)用效果也十分顯著，作為乳化劑及活性物質(zhì)運(yùn)送基質(zhì)具有重要意義。很多研究已對(duì)美拉德型蛋白-多糖糖基化產(chǎn)物的反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行了討論，大分子擁擠體系改變產(chǎn)物的接枝度，進(jìn)而對(duì)其功能特性產(chǎn)生影響。在大分子擁擠體系的基礎(chǔ)上，通過分級(jí)分離手段獲得的糖基化產(chǎn)物的物化性質(zhì)研究備受關(guān)注[20]。

本實(shí)驗(yàn)將通過美拉德反應(yīng)制備SPI-葡聚糖共價(jià)接枝物，并且根據(jù)在酸性條件下溶解度的差異將接枝物分離的產(chǎn)物應(yīng)用于蛋白等電點(diǎn)附近水包油乳液及制備姜黃素納米顆粒體系中。著重研究等電點(diǎn)條件下制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與中性條件下制備的產(chǎn)物在水包油乳化體系中的貯藏穩(wěn)定性和對(duì)疏水活性物質(zhì)姜黃素的運(yùn)載性能，比較兩組分在不同體系中的功能性質(zhì)差異，為其工業(yè)應(yīng)用提供指導(dǎo)。探討改變?nèi)橐簆H值、添加鹽離子和熱處理對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響；表征納米顆粒的荷載率、粒度、電位和微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)膠體和化學(xué)穩(wěn)定性進(jìn)行對(duì)比，引入了一種新的包裝材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂大豆粕 山東禹王有限公司；姜黃素（純度＞90%） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜系統(tǒng)（2487高效液相泵、2487紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器） 美國(guó)Waters公司；Himac CR 22G高速冷凍離心機(jī)、CS150NX超速離心機(jī) 日本Hitachi公司；Alpha-4冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；Rapid N Dumas定氮儀法國(guó)Elementar公司；DYCZ-30垂直板電泳儀 北京六一儀器廠；UV2300紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美公司；Nano-ZS激光動(dòng)態(tài)粒度掃描儀、Mastersizer 2000激光粒度儀 英國(guó)Malvern公司；MultiMode SPM掃描電子顯微鏡 美國(guó)Veeco公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

根據(jù)Frankel等[21]的方法，從低溫脫脂豆粕中提取。蛋白含量使用凱氏定氮法測(cè)定約為（86.86±0.79）%（N含量×6.25）。

1.3.2 SPI-葡聚糖糖基化物的制備及分級(jí)分離

在大分子擁擠體系條件下，通過美拉德反應(yīng)制備SPI-葡聚糖糖基化產(chǎn)物。將SPI與葡聚糖（1∶3，m/m）混合后分散于磷酸鹽緩沖溶液中（10 mmol/L，pH 6.8），質(zhì)量濃度分別為5 g/100 mL和15 g/100 mL。溶液攪拌至充分溶解，于4 ℃過夜充分水化，恒溫95 ℃條件下加熱攪拌6 h，立即通過冰浴結(jié)束美拉德反應(yīng)，得到樣品為美拉德產(chǎn)物（SPI-dextran conjugates，CON）。用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)糖基化產(chǎn)物pH值至4.5，攪拌2 h后離心（10 000×g，30 min），其中取上清液回調(diào)pH 6.8并透析、冷凍干燥后得到組分MC45。離心后沉淀以質(zhì)量比1∶10的比例用磷酸緩沖液復(fù)溶，使用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5，10 000×g離心30 min，將上清液透析、冷凍干燥后得到組分MC65。采用Dumas法測(cè)得凍干的MC45和MC65樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.21%和70.33%（干質(zhì)量，N含量×5.71）。SPI與葡聚糖據(jù)上述比例混合、凍干，得到樣品為MIX。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

依據(jù)Laemmli[22]的方法進(jìn)行SDS-PAGE。將樣品置于樣品緩沖液中（0.125 mol/L Tris-HCl緩沖液，含1 g/100 mL SDS，體積分?jǐn)?shù)5%甘油溶液，體積分?jǐn)?shù)2%2-巰基乙醇溶液和0.025 g/100 mL溴酚藍(lán)溶液），電泳前煮沸5 min，10 000×g離心10 min，取上清液上樣，上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，上樣量為10 μL。分離膠為13%，濃縮膠為5%。凝膠電泳于恒定電流條件下進(jìn)行，樣品在濃縮膠中的電流設(shè)定為20 mA，樣品進(jìn)入濃縮膠與分離膠界面后，將電流調(diào)節(jié)為40 mA，當(dāng)電泳跑至距離電泳槽橡膠底邊約1.5 cm時(shí)，關(guān)閉電源。分別用考馬斯亮藍(lán)R-250試劑和PAS染色法對(duì)凝膠膠片進(jìn)行蛋白質(zhì)及糖染色。脫色完成后，對(duì)膠片拍照并進(jìn)行分析。

1.3.4 分子質(zhì)量分布測(cè)定

糖基化產(chǎn)物的生成及其分子質(zhì)量分布使用高效液相色譜測(cè)定。SE-HPLC在Waters高效液相色譜系統(tǒng)中執(zhí)行，色譜柱為TSK G 4000 PW XL（300 mm×7.8 mm，10 μm）。其中流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，50 mmol/L NaCl），樣品過濾膜（0.45 μm）后利用超聲脫氣，洗脫速率為0.6 mL/min，洗脫液在波長(zhǎng)280 nm處檢測(cè)，柱溫25 ℃。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品分別用磷酸緩沖液配制為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的標(biāo)準(zhǔn)樣品液，進(jìn)樣量為20 μL。取0.05 g樣品用流動(dòng)相配成質(zhì)量濃度為5 g/L的樣液，高速離心（9 300×g，10 min），上清液過0.22 μm水相微孔濾膜過濾，按照上述色譜條件進(jìn)行分析。用于繪制分子質(zhì)量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別為：甲狀腺球蛋白（669 kDa）、鐵蛋白（430 kDa）、醛縮酶（158 kDa）、伴清蛋白（75 kDa）和卵白蛋白（43 kDa）。

1.3.5 乳液的制備

參考Zhu Dan等[19]的方法，并稍作修改。將SPI、MIX、CON、MC45和MC65樣品過夜水化，與純化的玉米油混合?；旌衔锿ㄟ^均質(zhì)后（10 000×g，2 min）再通過高壓微射流處理2 次（40 MPa）。最后得到蛋白質(zhì)量濃度為1 g/100 mL，油質(zhì)量濃度為20 g/100 mL的乳液。在制備好的乳液中添加0.04 g/100 mL疊氮鈉抑制微生物的生長(zhǎng)。

乳液的酸耐受性測(cè)定：將新鮮的乳液調(diào)節(jié)pH值為3.0～7.0。乳液的熱耐受性質(zhì)測(cè)定：新鮮乳液調(diào)節(jié)pH值為3.0，30、50、70 ℃和90 ℃條件下進(jìn)行熱處理，處理時(shí)間為30 min，處理后立即冷卻。離子濃度對(duì)乳液影響的測(cè)定：在新鮮的乳液中加入NaCl后使乳液中離子濃度為0、50、100 mmol/L和200 mmol/L，并且調(diào)節(jié)pH值為3.0。所有制備的乳液在室溫條件下放置24 h后測(cè)定。

1.3.6 粒度分布和Zeta電位測(cè)定

樣品的乳液采用Mastersizer 3000粒度分布儀測(cè)定乳狀液滴的粒徑大小。實(shí)驗(yàn)采用d43，體積平均直徑來表征液滴平均粒徑。

樣品的Zeta電位采用Zetasizer Nano-ZS儀器測(cè)量。激光器為4 mV的He-Ne激光器，入射波長(zhǎng)為633 nm，25 ℃條件下測(cè)量3 次取平均值。

1.3.7 姜黃素納米顆粒的制備

參考Patel等[23]的方法制備姜黃素納米顆粒。將樣品（蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為1 mg/mL）分散于磷酸緩沖液中（10 mmol/L，pH 6.8），滴加溶于無水乙醇的姜黃素溶液（3 mg/mL）最終質(zhì)量濃度為150 μg/mL。離心（4 ℃，10 000×g，20 min）后，將上清液避光保存于4 ℃待用。

1.3.8 復(fù)合納米顆粒姜黃素荷載量的測(cè)定

使用高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行荷載量分析，并連接紫外分光光度檢測(cè)器[24]。將姜黃素溶于甲醇，在20.0 mL容量瓶中定容，終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。將溶液超聲處理5 min。用甲醇（1.0 mg/mL）稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，試樣制備不同質(zhì)量濃度溶液備用（0.5～75.0 μg/mL）。

測(cè)定姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.44x＋0.001 5，x和y分別為吸光度和質(zhì)量濃度（μg/mL），R2=0.999 4。取5 mg樣品加入5 mL無水乙醇中充分振蕩，以C18為分離柱，甲醇為流動(dòng)相，利用高效液相色譜測(cè)定波長(zhǎng)420 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同樣品的姜黃素質(zhì)量濃度。取3 次結(jié)果平均值。

1.3.9 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定

參考O’Regan等[25]的方法分析納米顆粒的抗氧化活性分析。用無水乙醇溶解19.72 mg姜黃素納米顆粒定容至50 mL，用無水乙醇稀釋10 倍備用；將稀釋至200 μg/mL樣品取1.5 mL和1.5 mL DPPH溶液充分混勻，靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定待測(cè)樣品的吸光度。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算：

式中：A0和A1分別為蒸餾水和樣品反應(yīng)液吸光度。

1.3.10 納米顆粒微觀結(jié)構(gòu)分析

將樣品均勻黏附于掃描電子顯微鏡的樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金。對(duì)薄片進(jìn)行拍照，拍照時(shí)的電壓為15 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI-葡聚糖糖基化物的形成與鑒定

2.1.1 SDS-PAGE分析

圖1 蛋白質(zhì)染色（A）和糖染色（B）的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns with protein staining (A) and carbohydrate staining (B)

通過SDS-PAGE鑒定共價(jià)復(fù)合物的形成，結(jié)果如圖1所示。蛋白質(zhì)染色和糖染色分離膠的頂部產(chǎn)生高分子質(zhì)量的產(chǎn)物，證明大分子糖基化產(chǎn)物的形成。蛋白染色中，MC45組分的條帶較MC65組分淺，而在糖染色中顯示出相近的糖含量，說明了MC45組分接枝程度較高。蛋白質(zhì)染色中，MC65組分底端中有小分子物質(zhì)存在，條帶較為分散。說明大分子體系條件下，蛋白發(fā)生水解生成小分子物質(zhì)。糖基化物經(jīng)過不同的pH值分級(jí)分離，得到的MC45組分中只存在大量高分子糖基化產(chǎn)物，而MC65中則存在較多小分子物質(zhì)。

2.1.2 分子質(zhì)量分析

圖2 糖基化分級(jí)分離組分的凝膠排阻色譜Fig. 2 Gel permeation chromatography of conjugates and control samples

如圖2所示，樣品在33 min左右出現(xiàn)的峰形為溶劑峰。糖基化產(chǎn)物及其分級(jí)分離產(chǎn)物的出峰時(shí)間比較集中，進(jìn)一步說明其分子質(zhì)量的分布比較集中。與MC45相比，MC65組分出現(xiàn)2 個(gè)峰，在20～28 min出現(xiàn)的峰為糖基化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布區(qū)間，緊隨其后出現(xiàn)的小峰可能是糖基化過程中未反應(yīng)及水解的蛋白組分，其平均分子質(zhì)量為68 913 kDa。MC45組分的平均分子質(zhì)量最大，為74 132 kDa，而SPI的平均分子質(zhì)量為9 257 kDa。結(jié)合電泳分析可知，其多糖與蛋白的糖基化程度較高，同時(shí)存在的未反應(yīng)葡聚糖分子的分子質(zhì)量分布與MC45組分相近，故分子質(zhì)量較高且分布集中。結(jié)合SDS-PAGE、分子質(zhì)量分布結(jié)果分析以及Weng Jingyi等[20]的研究，大分子體系條件下制備的糖基化產(chǎn)物經(jīng)過分級(jí)分離后制備得到的2 個(gè)組分顯示出不同的物化特征，對(duì)其功能特性可能產(chǎn)生較大影響。

2.2 糖基化物穩(wěn)定的乳液乳化性質(zhì)分析

2.2.1 pH值對(duì)不同糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的乳液性質(zhì)影響

蛋白穩(wěn)定乳液的突出問題是乳液在蛋白等電點(diǎn)附近的絮凝。與天然蛋白相比，很多共價(jià)復(fù)合物已顯示出良好的酸耐受性能。然而，蛋白等電點(diǎn)附近乳液的穩(wěn)定性仍然沒有達(dá)到預(yù)期的效果。本實(shí)驗(yàn)希望通過分級(jí)分離手段改善乳液的酸穩(wěn)定性。

圖3 pH值對(duì)SPI、MIX和不同條件分級(jí)分離糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定乳液性質(zhì)的影響Fig. 3 Influence of pH on the properties of the emulsions stabilized with SPI, MIX and SPI-dextran conjugates

如圖3所示，由SPI制備的乳液粒徑明顯受到pH值的影響，在等電點(diǎn)附近獲得最大值（SPI制備的乳液最大粒徑約為14 μm）。與中性條件下制備的乳液相比，當(dāng)pH 4.5時(shí)，乳液的Zeta電位絕對(duì)值接近零，液滴間的相互排斥作用大大減弱，導(dǎo)致聚集作用增強(qiáng)。MIX制備乳液的Zeta電位與粒徑變化與SPI在不同pH值條件下變化趨勢(shì)幾乎相近，說明未發(fā)生共價(jià)結(jié)合的葡聚糖對(duì)SPI的乳化性影響較小。由此可見，SPI-葡聚糖非共價(jià)混合物的乳化性能借助于蛋白表面靜電相互排斥作用。

MC45組分制備的乳液平均粒徑為10 μm左右，并且不隨pH值的變化而變化。其Zeta電位值變化較小，絕對(duì)值接近零。以上現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于MC45組分中的多糖分子對(duì)蛋白表面電荷的屏蔽作用，導(dǎo)致乳液液滴表面凈電荷減少。MC45組分在SPI等電點(diǎn)附近優(yōu)越的乳化性質(zhì)由于糖基化程度較高，為體系增加了空間位阻作用，同時(shí)展現(xiàn)了葡聚糖耐受pH值干擾的特性，油滴周圍覆蓋的糖層明顯削弱了酸性環(huán)境的不利影響。與天然蛋白相比，MC65組分制備的乳液液滴表面電荷較低，與未經(jīng)過分級(jí)分離的糖基化產(chǎn)物相近。然而，MC65制備乳液的平均粒徑隨pH值變化顯著，在SPI等電點(diǎn)附近平均粒徑大于30 μm。由于其糖基化程度較低，空間位阻作用弱，并且組分中存在未參加糖基化過程的天然蛋白及水解物，導(dǎo)致乳液液滴聚集程度增加。在酸性環(huán)境中，葡聚糖的加入形成消耗性絮凝可能是MC65組分乳化穩(wěn)定性降低的原因。

通過研究pH值對(duì)分級(jí)分離糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定乳液的研究，分級(jí)分離產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性結(jié)果差異明顯，對(duì)糖基化產(chǎn)物的功能特性開發(fā)應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

2.2.2 離子濃度對(duì)不同糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的乳液性質(zhì)影響

圖4 NaCl濃度對(duì)SPI、MIX和不同條件分級(jí)分離糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定乳液的性質(zhì)的影響Fig. 4 Influence of NaCl concentration on the properties of the emulsions stabilized with SPI, MIX and SPI-dextran conjugates

如圖4a所示，隨著離子濃度的增加，各組分制備的乳液液滴表面電荷顯著減小。其結(jié)果與很多糖基化物研究結(jié)果一致，鹽離子對(duì)帶電顆粒溶液或乳液有一定的屏蔽作用[26-27]。在酸性條件下，SPI及MIX的平均粒徑隨著離子濃度的增加而增加。結(jié)合Zeta電位分析結(jié)果，進(jìn)一步說明未經(jīng)過糖基化的葡聚糖加入對(duì)SPI的修飾作用較弱，不能有效改善其功能特性。MC45組分制備的乳液Zeta電位值表明其表面電荷受到離子濃度的影響極小，其平均粒徑也不受離子濃度的影響。MC45組分中葡聚糖與蛋白高效共價(jià)接枝，一定程度改變了蛋白的物化性質(zhì)，進(jìn)而對(duì)其乳化穩(wěn)定性產(chǎn)生了積極作用。MC65組分制備的乳液受離子濃度影響很大，一方面其糖基化程度低，多糖對(duì)蛋白的修飾作用不明顯，另一方面由于組分中存在可溶解的蛋白聚集物、天然蛋白及蛋白水解物等，導(dǎo)致其功能特性表征較差。

2.2.3 熱處理對(duì)不同糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定的乳液性質(zhì)影響

圖5 熱處理對(duì)SPI、MIX和不同條件分級(jí)分離糖基化產(chǎn)物穩(wěn)定乳液性質(zhì)的影響Fig. 5 Influence of thermal treatment on the properties of the emulsions stabilized with SP, MIXI and SPI-dextran conjugates

如圖5所示，在酸性條件下，天然SPI制備的乳液經(jīng)過熱處理后Zeta電位絕對(duì)值減小較其他組分明顯，平均粒徑隨著溫度的升高明顯增加。當(dāng)SPI與葡聚糖通過糖基化反應(yīng)形成共價(jià)復(fù)合物后，由于葡聚糖包裹在蛋白的表面，共價(jià)復(fù)合物制備的乳液液滴表面電荷變化較小。MC45組分制備的乳液平均粒徑在加熱過程中變化較小，表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。而MC65組分制備的乳液平均粒徑在加熱溫度大于50 ℃時(shí)，粒徑明顯增大。

糖基化產(chǎn)物分級(jí)分離后在酸性條件下的乳化性質(zhì)差異較大，對(duì)pH值、離子濃度以及溫度耐受性差異明顯。大分子體系環(huán)境中制備的糖基化產(chǎn)物經(jīng)過分級(jí)分離對(duì)糖基化產(chǎn)物的研究具有重要意義。

2.3 姜黃素納米顆粒性能表征

2.3.1 荷載量分析

蛋白質(zhì)-多糖納米復(fù)合物已經(jīng)廣泛用于在過去幾十年中的藥物和營(yíng)養(yǎng)物的遞送[28-29]。姜黃素是近年來備受關(guān)注的生物活性成分，但在水中溶解性較差，生物利用率極低，并且在胃腸液中易發(fā)生化學(xué)或代謝降解。如圖6所示，姜黃素水溶液渾濁，加入SPI、MIX和糖基化產(chǎn)物后溶液不同程度地澄清。結(jié)合姜黃素荷載量的結(jié)果，分析SPI、MIX和不同條件分級(jí)分離得到的糖基化產(chǎn)物對(duì)姜黃素荷載能力。中性條件下，MC45、MC65、CON 3 種復(fù)合納米顆粒的姜黃素荷載量較高，分別為18.37、30.21 μg/mg和24.62 μg/mg（表1）。與SPI和MIX相比，糖基化產(chǎn)物具有良好的荷載能力。已有研究證明，蛋白質(zhì)用作親脂性化合物的物質(zhì)空間，而由親水性片段組成的殼保護(hù)蛋白質(zhì)免于在胃中的酶水解，并確保在腸內(nèi)控制釋放。根據(jù)糖基化產(chǎn)物分離后得到不同組分的物化性質(zhì)差異，親疏水平衡后對(duì)姜黃素表現(xiàn)的運(yùn)載能力也不同，糖基化程度較高的MC45組分由于其親水性較強(qiáng)，故荷載量較低。

圖6 姜黃素水溶液和不同組分荷載姜黃素蛋白水溶液外觀圖Fig. 6 Visual observations of free curcumin and curcumin-loaded proteins

表1 SPI、MIX和分級(jí)分離糖基化產(chǎn)物包埋姜黃素的荷載量及粒度Table 1 Loading amount and size of curcumin in SPI-dextran conjugates

2.3.2 DPPH自由基清除率分析

圖7 SPI-葡聚糖分級(jí)分離糖基化產(chǎn)物DPPH自由基清除能力Fig. 7 DPPH scavenging capacity of soy dextran conjugates and fractions

姜黃素多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的游離基清除能力，但是在強(qiáng)氧化條件易發(fā)生氧化而失去活性。需要特殊的包埋材料保護(hù)。如圖7所示，SPI和MIX組分在包埋姜黃素后對(duì)DPPH自由基的清除率接近，在50%～60%范圍內(nèi)。而CON對(duì)DPPH自由基的清除率為15%左右，其對(duì)游離基的敏感度下降，對(duì)姜黃素起到保護(hù)作用。MC45和MC65組分DPPH自由基的清除率分別為8.43%和18.33%。與MC65比較，MC45荷載量較小，但是對(duì)姜黃素活性物質(zhì)的保護(hù)作用增強(qiáng)，原因是等電點(diǎn)條件下得到的MC45組分糖基化程度高。根據(jù)Weng Jingyi[20]、Sasahara[30]等的研究，糖基化產(chǎn)物經(jīng)過分級(jí)分離后的產(chǎn)物接枝程度不同，MC45包埋姜黃素提高DPPH游離基穩(wěn)定性的原因可能是由于其結(jié)構(gòu)對(duì)外界氧化劑的隔絕作用增強(qiáng)，減少同外界的氧氣、光線以及氧化劑的接觸。

2.3.3 掃描電子顯微鏡分析

圖8 SPI-葡聚糖分級(jí)分離糖基化產(chǎn)物包埋姜黃素電子顯微鏡掃描圖Fig. 8 SEM photos of curcumin-loading nanoparticles with SPI-dextran conjugates and fractions

由圖8可知，SPI制備的姜黃素納米顆粒呈現(xiàn)典型冷凍干燥樣品無定型片狀結(jié)構(gòu)。圖8b顯示大量海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，有利于樣品水化，提高樣品水溶解性，與本實(shí)驗(yàn)前文研究結(jié)果一致。如圖8c所示，MC45組分包埋姜黃素納米顆粒中顯示較多的圓球形結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)后可見完整的球狀結(jié)構(gòu)，表明MC45通過反溶劑法包埋姜黃素主要形成了球狀納米顆粒（圖8e）。

3 結(jié) 論

大分子擁擠體系條件下，SPI和葡聚糖通過美拉德反應(yīng)生成了糖基化產(chǎn)物，根據(jù)不同溶解度將產(chǎn)物分級(jí)分離得到MC45和MC65組分。兩組分的乳化穩(wěn)定性及制備得到的姜黃素納米顆粒性能存在較大差異。MC45穩(wěn)定的乳液對(duì)pH值、離子濃度和熱處理都具有較高的耐受性，MC65穩(wěn)定的乳液受環(huán)境因素干擾較大，乳化穩(wěn)定性較差。相反，利用反溶劑納米沉淀法制備的納米顆粒使姜黃素水溶性得到改善，并且MC65的荷載量大于MC45。相對(duì)表面疏水性較強(qiáng)的MC65與姜黃素的相互作用更強(qiáng)，對(duì)姜黃素的荷載量更高，MC45則荷載量較低。分離分級(jí)手段制備的糖基化產(chǎn)物為其應(yīng)用提供更多的可能性，需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] LEE Y Y, TANG T K, PHUAH E T, et al. New functionalities of Maillard reaction products as emulsifiers and encapsulating agents, and the processing parameters: a brief review[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2016, 97(5): 1379-1385. DOI:10.1002/jsfa.8124.

[2] FENG X, CHEN L, ZHU X W, et al. Comparative studies on the physicochemical properties of soy protein isolate-maltodextrin and soy protein isolate-gum acacia conjugate prepared through Maillard reaction[J]. Food Research International, 2013, 51(2): 490-495.DOI:10.1016/j.foodres.2013.01.012.

[3] KARAN M, CUI S W, GOFF H D. Emulsifying properties of soy whey protein isolate-fenugreek gum conjugates in oil-in-water emulsion model system[J]. Food Hydrocolloids, 2013, 30(2): 691-697.DOI:10.1016/j.foodhyd.2012.09.002.

[4] AL-HAKKAK J, AL-HAKKAK F. Functional egg white-pectin conjugates prepared by controlled Maillard reaction[J]. Journal of Food Engineering, 2010, 99(1): 152-159. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2010.03.040.

[5] TAMNAK S, MIRHOSSEINI H, TAN C P, et al. Physicochemical properties, rheological behavior and morphology of pectin-pea protein isolate mixtures and conjugates in aqueous system and oil in water emulsion[J]. Food Hydrocolloids, 2016, 56: 405-416. DOI:10.1016/j.foodhyd.2015.12.033.

[6] TAKAHASHI K, LOU X F, ISHII Y, et al. Lysozyme-glucose stearic acid monoester conjugate formed through the Maillard reaction as an antibacterial emulsifier[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2000, 48(6): 2044-2049. DOI:10.1021/jf990989c.

[7] CHEN L, XUE H R, CHEN Z Y, et al. Comparative studies on the physicochemical properties of peanut protein isolate-polysaccharide conjugates prepared by ultrasonic treatment or classical heating[J].Food Research International, 2014, 57: 1-7. DOI:10.1016/j.foodres.2013.12.038.

[8] AJONGWEN W J, BARKER P E. Scale-up of non-aerated fermentation of dextransucrase and the industrial synthesis of dextran using enzymatic route[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1993, 56: 113-118. DOI:10.1002/chin.199316287.

[9] LAZIC M L, VELZKOVIC V B, VUCETIC J I, et al. Effect of pH and aeration on dextran production by Leuconostoc mesenteroides[J].Enzyme and Microbial Technology, 1993, 15(4): 334-338.DOI:10.1016/0141-0229(93)90160-4.

[10] EL-SAYED A H M M, MAHMOUD W M, COUGHLIN R W. Production of dextransucrase and dextran by Leuconostoc mesenteroides immobilized in calcium-alginate beads: II.Semicontinuous fed-batch fermentations[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1990, 36: 346-353. DOI:10.1002/bit.260360405.

[11] LEBRUN L, JUNTER G A, JOUENNE T, et al. Exopolysaccharide production by free and immobilized microbial cultures[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1994, 16(12): 1048-1054. DOI:10.1016/0141-0229(94)90141-4.

[12] NAESSENS M, CERDOBBEL A, SOETAERT W, et al. Leuconostoc dextransucrase and dextran: production, properties and applications[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2005, 80(8): 845-860. DOI:10.1002/jctb.1322.

[13] SPOTTI M J, PERDUCA M, PIAGENTINI A, et al. Dose dextran molecular weight affect the mechanical properties of whey protein/dextran conjugate gels[J]. Food Hydrocolloids, 2013, 32(1): 204-210.DOI:10.1016/j.foodhyd.2012.12.022.

[14] SHAVEJ A, RICHARD F T, ALISTAIR C, et al. Dextran and 5-aminosalicylic acid (5-ASA) conjugates: synthesis, characterisation and enzymic hydrolysis[J]. Carbohydrate Research, 2006, 341(16):2694-2701. DOI:10.1016/j.carres.2006.08.015.

[15] WAN Z L, GUO J, YANG X Q. Plant protein-based delivery systems for bioactive ingredients in foods[J]. Food Function, 2015, 6(9): 2876-2889. DOI:10.1039/c5fo00050e.

[16] NISHINARI K, FANF Y, GUO S, et al. Soy proteins: a review on composition, aggregation and emulsification[J]. Food Hydrocolloids,2014, 39(2): 301-318. DOI:10.1016/j.foodhyd.2014.01.013.

[17] YANG Y X, CUI S W, GONG J, et al. A soy protein-polysaccharides Maillard reaction product enhanced the physical stability of oil-inwater emulsions containing citral[J]. Food Hydrocolloids, 2015, 48:155-164. DOI:10.1016/j.foodhyd.2015.02.004.

[18] FENG J, WU S S, WANG H, et al. Improved bioavailability of curcumin in ovalbumin-dextran nanogels prepared by Maillard reaction[J]. Journal of Functional Foods, 2016, 27: 55-68.DOI:10.1016/j.jff.2016.09.002.

[19] ZHU D, DAMODARAN S, LUCEY J A. Physicochemical and emulsifying properties of whey protein isolate (WPI)-dextran conjugates produced in aqueous solution[J]. Ournal of Agricultural &Food Chemistry, 2010, 58(5): 2988-2994. DOI:10.1021/jf903643p.

[20] WENG J Y, QI J R, YIN S W, et al. Fractionation and characterization of soy β-conglycinin-dextran conjugates via macromolecular crowding environment and dry heating[J]. Food Chemistry, 2016, 196: 1264-1271. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.10.072.

[21] FRANKEL E, HUANG S, KANNER J, et al. Interfacial phenomena in the evaluation of antioxidants: bulk oils vs. emulsions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42: 1054-1059. DOI:10.1021/jf00041a001.

[22] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227(5259): 680-685.

[23] PATEL A, HU Y, TIWARI J K, et al. Synthesis and characterisation of zein-curcumin colloidal particles[J]. Soft Matter, 2010, 6(24): 6192-6199. DOI:10.1039/C0SM00800A.

[24] FONSECA-SANTOS B, GREMI?O M P D, CHORILLI M. A simple reversed phase high-performance liquid chromatography (HPLC)method for determination of in situ gelling curcumin-loaded liquid crystals in in vitro performance tests[J]. Arabian Journal of Chemistry,2016, 6(10): 1-14. DOI:10.1016/j.arabjc.2016.01.014.

[25] O’REGAN J, MULVIHILL D M. Preparation, characterisation and selected functional propertie of sodium caseinate-maltodextrin conjugates[J]. Food Chemistry, 2009, 115: 1257-1267. DOI:10.1016/j.foodchem.2009.01.045.

[26] QIAN C, DECKER E A, XIAO H, et al. Comparison of biopolymer emulsifier performance in formation and stabilization of orange oil-inwater emulsions[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,2011, 88(1): 47-55. DOI:10.1007/s11746-010-1658-y.

[27] ZHANG J B, WU N N, LAN T, et al. Improvement in emulsifying properties of soy protein isolate by conjugation with maltodextrin using high-temperature, short-time dry-heating Maillard reaction[J].International Journal of Food Science & Technology, 2014, 49(2):460-467. DOI:10.1111/ijfs.12323.

[28] CHEN F P, OU S Y, TANG C H. Core-shell soy protein-soy polysaccharide complex (nano) particles as carriers for improved stability and sustained release of curcumin[J]. Journal of Agricultural &Food Chemistry, 2016, 64: 5053-5059. DOI:10.1021/acs.jsfc.6b01176.

[29] WANG C N, LIU Z J, XU G R, et al. BSA-dextran emulsion for protection and oral delivery of curcumin[J]. Food Hydrocolloids, 2016,61: 11-19. DOI:10.1016/j.foodhyd.2016.04.037.

[30] SASAHARA K, MCPHIE P, MINTON A P. Effect of dextran on protein stability and conformation attributed to macromolecular crowding[J]. Journal of Molecular Biology, 2003, 326(4): 1227-1237.DOI:10.1016/S0022-2836(02)01443-2.