mok E基因過(guò)表達(dá)對(duì)紅曲霉Monacolin K產(chǎn)量、菌絲及孢子形態(tài)的影響

林 琳，王昌祿*，李貞景，陳勉華，武淑芬，任志遠(yuǎn)

紅曲霉（Monascus spp.）具有有性生殖和無(wú)性生殖2 個(gè)生殖期。有性生殖期形成子囊和閉囊殼，無(wú)性繁殖過(guò)程中形成分生孢子[1]。紅曲是以大米為原料，經(jīng)過(guò)紅曲霉發(fā)酵而成的一種紫紅色米曲，被李時(shí)珍稱為“造化之巧著”，是藥食兩用之奇才[2-3]。紅曲色素是一種天然染色劑，同時(shí)紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物還具有降血脂、降血壓、抑制癌細(xì)胞增殖等功效[4-12]。近年來(lái)，紅曲發(fā)酵產(chǎn)物被用于治療登革熱病毒感染[13]。莫納可林K（Monacolin K，MK）又叫洛伐他汀，是功能性紅曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物中主要功能成分[14-15]。不同培養(yǎng)基種類能夠影響MK產(chǎn)量[16-19]。祁田甜等[20]通過(guò)等離子體誘變技術(shù)選育高產(chǎn)MK的紅曲霉突變株。2010年，Chen Yipei等[21]將mok H基因過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能夠提高M(jìn)K產(chǎn)量。

紅曲霉mok E基因?qū)?yīng)編碼脫氫酶，該脫氫酶與土曲霉中由lov C編碼的烯醇還原酶相似度為84%[22]。研究表明，lov C編碼的烯醇還原酶能催化反應(yīng)，使土曲霉MK合成前體物質(zhì)——九酮化合物[23]。本課題組基于前期研究結(jié)果，確定了表達(dá)量與MK產(chǎn)量呈正相關(guān)的基因[17]。選取MK生物合成基因簇中mok E基因進(jìn)行基因過(guò)表達(dá)，以提高M(jìn)K產(chǎn)量，通過(guò)掃描電鏡對(duì)轉(zhuǎn)化子菌絲體及孢子形態(tài)進(jìn)行觀察，為進(jìn)一步研究基因過(guò)表達(dá)與MK產(chǎn)量及菌體、孢子之間的相關(guān)性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

紅曲霉M1由天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)研究室保存。

大麥芽、大米 市售；RNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；GV3301農(nóng)桿菌、pCAMBIA1301質(zhì)粒 天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)研究室；T4連接酶、SYBRII Mix日本TaKaRa公司；HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒 康為世紀(jì)生物科技有限公司；Bsp119I、BglII內(nèi)切酶 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：將大麥芽粉碎，稱取500 g，加入2 L水，55～60 ℃保溫糖化3～4 h，濾去殘?jiān)?，煮沸、過(guò)濾，加水稀釋至糖度為12°Brix，加入3%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO310 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KH2PO410 g/L。取100 mL培養(yǎng)液分裝至250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：在液體種子培養(yǎng)基中加入3%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。超凈工作臺(tái)內(nèi)將培養(yǎng)基倒入已滅菌的平板中，待培養(yǎng)基凝固后，鋪上已剪好的無(wú)菌玻璃紙，將氣泡趕出，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；LRH-250-GII型培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；KCL-2000W型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 日本東京理化器械株氏會(huì)社；XL-3型掃描式電子顯微鏡 日本日立公司；SW-CJ-1FD型號(hào)超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 過(guò)表達(dá)載體連接與轉(zhuǎn)化

對(duì)pCAMBIA1301質(zhì)粒及mok E基因（含酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基）通過(guò)Bsp119I及BglII分別進(jìn)行雙酶切，純化，在T4連接酶作用下16 ℃連接過(guò)夜[24]，連接產(chǎn)物經(jīng)雙酶切驗(yàn)證，確認(rèn)連接成功。連接產(chǎn)物通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)紅曲霉進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化步驟參考邵彥春[25]方法：將野生型紅曲霉孢子與經(jīng)乙酰丁香酮誘導(dǎo)劑處理的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，在含有潮霉素抗性培養(yǎng)基上涂布，30 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，有菌體長(zhǎng)出則為轉(zhuǎn)化子。

1.3.2 mok E基因表達(dá)水平的測(cè)定

分別稱取轉(zhuǎn)化子菌體100 mg，提取菌絲體RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）法測(cè)定mok E基因表達(dá)水平，確定mok E基因過(guò)表達(dá)成功的轉(zhuǎn)化子。RT-qPCR體系為：11 μL水；12 μL SYBRII Mix；1 μL cDNA；上下游引物各0.5 μL；總體系25 μL；每個(gè)樣品做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)程序如下：95 ℃、30 s循環(huán)1 次；95 ℃、5 s，57 ℃、20 s，72 ℃、15 s，共循環(huán)40 次。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 List of primers used in RT-qPCR

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物中MK的檢測(cè)

1.3.3.1 MK固態(tài)發(fā)酵及樣品處理

將在麥芽汁培養(yǎng)基上30 ℃活化7 d的紅曲霉M1接種至種子液培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，在無(wú)菌操作臺(tái)中用4～6 層無(wú)菌紗布過(guò)濾孢子懸液，用無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)至106個(gè)/mL。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中心位置加入20 μL孢子懸液，待菌液干燥后，30 ℃倒置培養(yǎng)6 d后，于25 ℃培養(yǎng)12 d。分別將培養(yǎng)至18 d的野生型紅曲霉M1及經(jīng)篩選的轉(zhuǎn)化子玻璃紙取下，剝落玻璃紙，得菌體，50 ℃烘干，研磨成粉末，稱取0.50 g。用10 mL 75%乙醇溶液分3 次進(jìn)行萃取，每次超聲30 min，3 500 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 MK標(biāo)準(zhǔn)品的制備及檢測(cè)

配制質(zhì)量濃度分別為5.00、10.00、50.00、100.00、200.00、400.00 μg/mL的MK標(biāo)準(zhǔn)溶液。用高效液相色譜法測(cè)定MK標(biāo)準(zhǔn)品，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 高效液相色譜檢測(cè)條件

檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm；色譜柱：Agilent X DB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸溶液體積比60∶40，等度洗脫。

1.3.3.4 掃描電鏡觀察

分別將野生型紅曲霉M1及轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)至18 d，取菌體，放置于2.5%戊二醛溶液中固定6 h，用pH 7.2，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，經(jīng)50%、70%、90%和100%乙醇溶液梯度脫水，每次15 min，冷凍干燥，待用。用Eiko IB-3型離子濺射儀噴金，XL-3型掃描式電子顯微鏡（20 kV）掃描[26-27]觀察形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒連接與轉(zhuǎn)化結(jié)果

mok E基因長(zhǎng)度為1 294 bp，連接于Bsp119I及BglII兩個(gè)位點(diǎn)之間。位于CaMV 35s啟動(dòng)子下游，mok E基因含有終止子。質(zhì)粒圖譜[24]如圖1所示。mok E基因片段全長(zhǎng)為1 294 bp，由圖2可知，在1 000～2 000 bp之間有片段，且與目的片段大小相符，表明mok E基因與pCAMBIA1301質(zhì)粒連接成功，可用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒圖譜Fig. 1 Schematic representation of the overexpression vector

圖2 連接產(chǎn)物雙酶切驗(yàn)證凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of pCAMBIA-mok E with double enzyme digestion

pCAMBIA1301質(zhì)粒含有潮霉素抗性基因，按照1.3.1節(jié)農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法，對(duì)連接好的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，共得到240 個(gè)轉(zhuǎn)化子，按照選取菌落直徑大、長(zhǎng)勢(shì)良好的9 個(gè)轉(zhuǎn)化子（部分轉(zhuǎn)化子如圖3所示）進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，結(jié)果表明5 代遺傳穩(wěn)定。

圖3 野生型及轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)Fig. 3 Morphological features of the wild-type strain and transformants

2.2 mok E基因表達(dá)量測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，WS M1為野生型紅曲霉M1菌株中mok E基因表達(dá)水平，T1轉(zhuǎn)化子為轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，作為陰性對(duì)照，其mok E基因水平未增加。T2、T8、T9菌株中mok E基因水平均增加，表明在T2、T8、T9菌株中mok E基因過(guò)表達(dá)成功，其mok E基因表達(dá)量分別為野生型mok E基因表達(dá)量的1.57、4.63、2.39 倍。

圖4 野生型紅曲霉M1與轉(zhuǎn)化子mok E基因表達(dá)水平Fig. 4 Expression levels of mok E gene in the wild-type strain M1 and transformants

2.3 MK產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果

2.3.1 MK標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)MK標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度及峰面積計(jì)算得到MK標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=63.48x＋13.50，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

2.3.2 野生型紅曲霉M1及轉(zhuǎn)化子內(nèi)酯型MK產(chǎn)量

圖5 野生型紅曲霉M1與4 株轉(zhuǎn)化子的內(nèi)酯型MK產(chǎn)量Fig. 5 Monacolin K lactone production by wild-type strain M1 and 4 transformants

由圖5可知，野生型紅曲霉M1 MK產(chǎn)量為1 447.8 μg/g，T2、T8、T9轉(zhuǎn)化子內(nèi)酯型MK產(chǎn)量增長(zhǎng)明顯，而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的T1轉(zhuǎn)化子內(nèi)酯型MK產(chǎn)量增長(zhǎng)不明顯，表明mok E基因過(guò)表達(dá)能夠提高紅曲霉MK產(chǎn)量。這與Chen Yipei等[21]的結(jié)論一致，對(duì)與MK產(chǎn)量呈正相關(guān)的基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)能夠提高M(jìn)K產(chǎn)量。其中，T8轉(zhuǎn)化子內(nèi)酯型MK產(chǎn)量最高為4 177.6 μg/g，比野生型紅曲霉內(nèi)酯型MK產(chǎn)量提高了188.5%。T2、T9轉(zhuǎn)化子內(nèi)酯型MK產(chǎn)量分別為2 159.7、3 365.7 μg/g，MK產(chǎn)量較野生型分別提高了49.2%、132.5%。

2.4 基因過(guò)表達(dá)對(duì)菌絲及孢子形態(tài)的影響

由圖6a可知，紅曲霉菌絲有大量分枝，菌絲體密實(shí)，多呈網(wǎng)結(jié)聯(lián)合，在分枝的頂端具有單個(gè)或成串的球形或橢圓形囊實(shí)體。這與Ji等[28]的描述一致。野生型紅曲霉存在大量的分生孢子，即在菌絲頂端或側(cè)面小梗頂端的倒梨形球體。由圖6b～d可知，T2、T8、T9轉(zhuǎn)化子中分生孢子數(shù)量少，球狀閉囊殼數(shù)量多。以分生孢子進(jìn)行的繁殖為無(wú)性繁殖，而產(chǎn)生閉囊殼的過(guò)程為有性繁殖[29]。這表明mok E基因過(guò)表達(dá)，對(duì)紅曲霉菌絲及孢子形態(tài)有一定的影響。推測(cè)mok E基因過(guò)表達(dá)使菌絲體長(zhǎng)度變短，菌絲之間網(wǎng)結(jié)聯(lián)合減少，從而促進(jìn)MK產(chǎn)生。而菌絲體較短，網(wǎng)聯(lián)結(jié)構(gòu)稀疏能夠促進(jìn)絲狀真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，這與王莉衡[30]的研究結(jié)果一致。有研究表明，利于菌絲生長(zhǎng)的環(huán)境也利于無(wú)性繁殖，即分生孢子的產(chǎn)生，但一般不利于有性繁殖[31]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 野生型M1及mok E基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子掃描電鏡（×800）Fig. 6 Scanning electron micrographs of wild-type strain M1 and mok E overexpressing transformants (× 800)

3 結(jié) 論

選取紅曲霉MK生物基因簇中mok E基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，共得到240 個(gè)轉(zhuǎn)化子；挑取菌落直徑大、生長(zhǎng)良好的9 個(gè)轉(zhuǎn)化子，測(cè)定其mok E基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)3 株mok E基因表達(dá)量增加的轉(zhuǎn)化子T2、T8、T9。MK產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果表明，T2、T8、T9轉(zhuǎn)化子內(nèi)酯型MK產(chǎn)量比野生型紅曲霉的內(nèi)酯型MK產(chǎn)量分別提高了49.2%、188.5%及132.5%。說(shuō)明mok E基因過(guò)表達(dá)能夠提高M(jìn)K產(chǎn)量。

對(duì)野生型紅曲霉M1及轉(zhuǎn)化子菌絲、孢子進(jìn)行掃描電鏡觀察。結(jié)果顯示mok E基因過(guò)表達(dá)，對(duì)紅曲霉的菌體生長(zhǎng)、孢子形態(tài)及生殖方式均有影響。推測(cè)mok E基因過(guò)表達(dá)是通過(guò)影響紅曲霉菌絲體及孢子的生長(zhǎng)，最終影響MK的產(chǎn)生。該結(jié)果對(duì)通過(guò)生物技術(shù)手段研究MK產(chǎn)生與菌體、孢子生長(zhǎng)的相關(guān)性提供了理論支持。

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