李進(jìn) 馬春明 梁翠宏 蔣吉英 竇全玲

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）03-0-01

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科臨床常見的病理生理過程，嚴(yán)重影響患者的視覺功能[1]。缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究證實(shí)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系[2，3]。N-乙酰-5-羥色胺（N-acetylserotonin，NAS）是一種自由基清除劑，對肝細(xì)胞、腦細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用[4]。有研究證實(shí)NAS可增加肝微粒體膜的穩(wěn)定性，課題組前期研究證實(shí)NAS可減輕肝缺血再灌注損傷小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的損傷，抑制肝細(xì)胞凋亡，改善肝臟功能[5，6]。但是近年來有關(guān)NAS對視網(wǎng)膜缺血再灌注的保護(hù)作用報道較少。本研究擬通過觀察NAS對視網(wǎng)膜細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，為開發(fā)治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的新藥、提高視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康成年SD大鼠30只，體重300g左右，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對照組（10只）、缺血再灌注組（10只）以及NAS組（10只），正常對照組不加干預(yù)，缺血再灌注組于造模前30min腹腔注射5mg/kg的生理鹽水，NAS組于造模前30min腹腔注射5mg/kg的NAS。

1.1.2 主要試劑 NAS（Sigma公司，美國）；HE染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，海門）；兔抗大鼠Bcl-2、兔抗大鼠Bax（Abcam公司，美國），免疫組化試劑盒（博奧森公司，北京）、DAB顯色劑（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京）。

1.2 方法

1.2.1 RIRI模型制作 按照文獻(xiàn)報道，采用右眼生理鹽水前房加壓灌注法制作視網(wǎng)膜缺血再灌注模型[7]。

1.2.2 組織切片制作 各組大鼠于RIRI 72 h后取眼球組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，將包埋好的標(biāo)本平行于視神經(jīng)矢狀軸進(jìn)行切片，切片厚約4μm。

1.2.3 HE染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木素液染色，雙蒸水沖洗，1%鹽酸酒精分化，雙蒸水沖洗，梯度酒精脫水，伊紅染色，95%鹽酸酒精分色，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 90?C烤片2h，常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽抗原修復(fù)，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，加入兔抗大鼠Bcl-2（1：500）和兔抗大鼠Bax（1：500）一抗并4?C孵育過夜，PBS緩沖液沖洗，加入二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，各層細(xì)胞排列緊密；缺血再灌注組大鼠視網(wǎng)膜各層高度水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逐漸減少且分布紊亂；NAS組較缺血再灌注組細(xì)胞水腫明顯減輕，細(xì)胞排列趨于規(guī)整，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少程度有顯著緩解。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達(dá)的變化 正常對照組視網(wǎng)膜可見大量Bcl-2陽性細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)為1580±23.75個·mm-2；缺血再灌注損傷組Bcl-2陽性細(xì)胞顯著下降，細(xì)胞數(shù)為845±17.89個·mm-2；NAS組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)為1258±18.45個·mm-2，顯著多于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜Bax蛋白表達(dá)的變化 正常對照組大鼠視網(wǎng)膜Bax陽性細(xì)胞較少，細(xì)胞數(shù)為98.75±15.98個·mm-2；缺血再灌注組Bax陽性細(xì)胞數(shù)為869.78±18.97個·mm-2；NAS組Bax陽性細(xì)胞顯著少于缺血再灌注組，為125.85±28.49個·mm-2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

N-乙酰-5-羥色胺（N-acetylserotonin，NAS）是一種自由基清除劑，對肝細(xì)胞、腦細(xì)胞等氧化損傷均具有保護(hù)作用[8]。SHAHAR等建立大鼠腸缺血再灌注損傷模型，觀察NAS對缺血再灌注后腸道細(xì)胞的保護(hù)作用，證實(shí)NAS可以抑制大鼠腸缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡，有效預(yù)防腸黏膜損傷[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NAS可減輕肝缺血再灌注損傷小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的損傷，改善肝臟功能，抑制肝細(xì)胞的凋亡[4]。本實(shí)驗(yàn)將NAS用于大鼠RIRI模型中，通過觀察大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的變化以及Bcl-2蛋白和Bax蛋白的改變，研究NAS對大鼠RIRI后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

HE染色結(jié)果證實(shí)正常對照組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，各層細(xì)胞排列緊密；缺血再灌注組大鼠視網(wǎng)膜各層高度水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逐漸減少且分布紊亂；NAS組較缺血再灌注組細(xì)胞水腫明顯減輕，細(xì)胞排列規(guī)整，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少程度有顯著緩解。Bcl-2家族成員在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，可阻斷細(xì)胞色素C的釋放，抑制下游凋亡反應(yīng)，而Bax是促凋亡蛋白，通過與Bcl-2而封閉其活性，同時促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10，11]。本研究證實(shí)NAS組RIRI后Bcl-2陽性細(xì)胞顯著多于缺血再灌注組，提示經(jīng)NAS干預(yù)后Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)。缺血再灌注損傷組RIRI后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層可見Bax陽性細(xì)胞，NAS組Bax陽性細(xì)胞顯著少于缺血再灌注損傷組，證實(shí)在NAS的作用下Bax蛋白表達(dá)降低。提示NAS抑制RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)并抑制Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

總之，NAS可促進(jìn)RIRI后大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，從而減輕細(xì)胞凋亡，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床治療RIRI提供了新思路和研究方法。

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