劉素芳，劉麗秋，楊鵬鵬

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，山東 青島266003)

如今，糖尿病的發(fā)病率伴隨著人們生活水平的改善正日益增高，糖尿病腎病(DK)作為糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病率也逐年攀升，成為糖尿病患者的主要死亡原因之一。NF-κB受體活化因子(RANK)及其配基RANKL是破骨細(xì)胞分化發(fā)育的關(guān)鍵作用因子[1-5]，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在表達(dá)于糖尿病和多種腎臟疾病[6，7]，而在早期2型糖尿病腎病中的表達(dá)研究較少。本研究建立2型糖尿病腎病大鼠模型，觀察腎臟中RANK、RANKL的表達(dá)，探討其在糖尿病腎病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)8周齡雄性Wista大鼠40只，體重(180±20)g，購于山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(魯)20130001)。鏈脲佐菌素( Streptozocin，STZ) (美國Sigma 公司)。兔抗鼠RANK、RANKL(美國Santa Cruz 公司)；山羊抗兔多克隆抗體(北京中杉金橋)；Trizol(日本Takara公司)；ACCU-CHEK血糖儀、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(上海羅氏)，血清胰島素(INS)ELISA試劑盒(武漢博士德)。

1.2模型建立和分組

動(dòng)物飼養(yǎng)的溫度控制在24-26℃，濕度65%，12 h交替照明。大鼠自由飲水、進(jìn)食。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組，n=18)和模型組(DM組，n=22)，NC組給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)。DM組給予高糖高脂飲食(常規(guī)飼料66.5%加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇、1%膽酸鹽)喂養(yǎng)8周后,DM組禁食12 h，空腹?fàn)顟B(tài)下STZ 30 mg/kg一次性腹腔注射，NC組僅注射等量枸櫞酸緩沖液。DM組注射STZ一周后，內(nèi)眥靜脈取血測(cè)定空腹血糖(FPG)及空腹胰島素(INS)，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)ISI[ISI=22．5/(FPG×INS)，HOMA法]。FPG大于該實(shí)驗(yàn)正常大鼠空腹血糖均值+3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(≥10．0 mmol/L)及胰島素敏感指數(shù)≤正常動(dòng)物均值(即胰島素抵抗)，即為T2DM模型建立成功，納入實(shí)驗(yàn)組。STZ注射2周后用代謝籠收集兩組大鼠24小時(shí)尿液，檢測(cè)24小時(shí)尿微量白蛋白。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明DM組大鼠24 h尿微量白蛋白定量較NC組高，說明糖尿病腎病DK動(dòng)物模型制備成功(共18只)。

1.3觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.3.1標(biāo)本收集 給藥后4、8、12周末分別用代謝籠收集大鼠24 h尿液，測(cè)尿量，稱體重，用10%水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血，4℃離心，取上層血清存于-80℃冰箱中待測(cè)生化指標(biāo)；取左腎，剪成1 mm腎皮質(zhì)以2．5%戊二醛固定用于電鏡檢測(cè)；取部分腎組織放于10%中性甲醛固定用于免疫組化；取右腎稱重后速凍于液氮中，凍透后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中待行Western-blot檢測(cè)。

1.3.2血、尿生化指標(biāo)檢測(cè) 利用日本日立公司的7020生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(FPG)、血肌酐(Scr)、總膽固醇(TC)、血甘油三酯(TG)、24小時(shí)尿白蛋白定量(UAL)。血清胰島素的檢測(cè)按照試劑盒說明書操作，采用ELISA法檢測(cè)。

1.3.3腎臟病理檢查 光鏡行HE染色放大200倍觀察腎臟病理變化。

1.3.4免疫組化染色 操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。一抗為RANK、RANKL多克隆抗體(均1∶200稀釋比)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image pro Plus 5.7圖像分析軟件對(duì)所選取視野中免疫組織化學(xué)陽性信號(hào)進(jìn)行圖像分析，光鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率(R)評(píng)分A(R<1%為0分，1%≤R≤10%為1分，10%

1.3.5Western 印跡法測(cè)蛋白 取凍存腎皮質(zhì)約150 mg，用BCA法測(cè)蛋白濃度，與5×上樣緩沖液混合煮沸5 rain后電泳。各泳道分別加彩色預(yù)染Marker及樣品蛋白進(jìn)行SDS、PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入待測(cè)多克隆抗體，過夜、洗膜，加二抗孵育2 h。用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描，掃描結(jié)果用GISl0分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)據(jù)化，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)組大鼠于造模三天后出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀,常有腹泄,毛發(fā)干枯發(fā)黃。實(shí)驗(yàn)過程中,隨時(shí)間的推移，體重明顯減輕,活動(dòng)量減少,精神萎靡。正常對(duì)照組大鼠皮毛光滑，毛色正常,體重隨周齡增加而增加,血糖值穩(wěn)定于正常水平,精神佳,飲食、飲水正常,尿淡黃色,大便顆粒狀。

2.2大鼠模型的建立

大鼠高糖高脂喂養(yǎng)8周后，DM組FPG和INS即高于NC組,ISI顯著降低，表明存在胰島素抵抗。STZ注射2周后，DM組FPG升高更加顯著，已達(dá)到糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，INS仍高于NC組，同時(shí)24小時(shí)尿微量白蛋白定量升高(P<0.05)，表明2型糖尿病腎病動(dòng)物模型制備成功(見表1)。

表1 不同時(shí)間各組大鼠血糖、胰島素的比較表

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01，aP<0.05

2.3各組大鼠生化指標(biāo)的比較

與NC組大鼠相比較,DK組大鼠FPG、UAL在造模4W、8W、12W末時(shí)均明顯升高 (均P<0.01)，而Scr、TG、TG在4W時(shí)開始升高(P<0.05)，8W、12 W時(shí)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；NC組大鼠上述指標(biāo)在4W、8W、12 W末時(shí)無明顯變化(P>0.05)，而DK組上述指標(biāo)在8W、12 W末較4W末存在明顯差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(見表2)。

表2 不同時(shí)間各組大鼠指標(biāo)的比較

注：同時(shí)間與對(duì)照組比較*P<0.01，#P<0.05；各組內(nèi)與4周末比較aP<0.01，bP>0.05

2.4各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，DK組的腎臟病理變化在4W時(shí)不明顯，8W時(shí)，DK組腎小球體積增大，系膜區(qū)面積增寬，局灶性的系膜基質(zhì)增加。12周時(shí)DK上述變化更加明顯，腎小球基底膜增厚，腎小囊腔明顯狹小，可見輕微腎小球硬化(見圖1)。

圖1 各組大鼠腎組織4周、8周和12周的病理變化 (HE×200)

2.5不同時(shí)間各組大鼠腎組織免疫組化和Westen-blot表達(dá)的比較

免疫組化可見RANK、RANKL在NC組大鼠腎臟極少表達(dá)，與NC組相比，DK組腎小球中RANK、RANKL陽性表達(dá)在4W時(shí)開始升高，8W、12W時(shí)增高更加顯著，且RANK、RANKL主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，腎間質(zhì)存在少量表達(dá)；DK組其RANK、RANKL表達(dá)在4W、8W、12W逐漸升高(見圖2、3)。Westen-blot結(jié)果與免疫組化的變化趨勢(shì)一致(見圖4)。

2.6相關(guān)分析結(jié)果

相關(guān)分析結(jié)果顯示RANK的免疫組化表達(dá)積分與血糖、尿蛋白的表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)，r分別為0.80、0.84，均P<0.01。

3 討論

隨著糖尿病的發(fā)病率逐年提高，其微血管并發(fā)癥之一糖尿病腎病(DK)已成為終末期腎病(ESRD)的重要原因，嚴(yán)重危害人類健康。DK以持續(xù)性蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)，隨著病情的進(jìn)展和尿蛋白量的增加，腎功能逐漸惡化，晚期可發(fā)展為腎小球硬化和腎臟纖維化[8,9]。臨床上糖尿病腎病的發(fā)病以2型多見，故本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂喂養(yǎng)加STZ注射法建立2型糖尿病腎病動(dòng)物模型[10,11]，實(shí)驗(yàn)中觀察到模型組大鼠高糖高脂喂養(yǎng)8周時(shí)血糖開始升高，出現(xiàn)胰島素抵抗。STZ注射2周后，模型組血糖及胰島素水平較對(duì)照組明顯升高，并出現(xiàn)蛋白尿。病理可見腎小球系膜基質(zhì)增多，基底膜較對(duì)照組明顯增厚，可見輕微腎小球硬化，證實(shí)這些大鼠DN模型已制作成功。

圖2 不同時(shí)間各組大鼠腎臟組織RANK的表達(dá)(免疫組化×200)

圖3 不同時(shí)間各組大鼠腎臟組織RANKL的表達(dá)(免疫組化×200)

圖4 不同時(shí)間各組大鼠腎組織RANK、RANKL的蛋白表達(dá)(Western印記)

RANK(NF-κB受體活化因子)及其配基RANKL作為TNF受體超家族成員之一，最初是在破骨細(xì)胞研究中被發(fā)現(xiàn)的，被證實(shí)為破骨細(xì)胞分化發(fā)育的關(guān)鍵作用因子[1-5]。既往的研究主要集中在骨系統(tǒng)疾病，近年來人們研究發(fā)現(xiàn)RANK/RANKL廣泛表達(dá)于各種組織和細(xì)胞，并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[12-14]。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血清可溶性RANKL濃度升高可以反映人類2型糖尿病的發(fā)病程度，通過下調(diào)小鼠肝細(xì)胞RANKL的表達(dá)和敲除小鼠RANK基因，可以明顯改善胰島素抵抗及血糖水平[14]。另外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)RANK/RANKL在正常足細(xì)胞上表達(dá)水平較低，在IgA腎病等人類腎小球疾病中表達(dá)明顯增加，且主要表達(dá)于足細(xì)胞[6,7]；嘌呤霉素氨基核苷及5/6切除腎鼠均可誘導(dǎo)足細(xì)胞產(chǎn)生RANK及RANKL，并誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[15,16]。而RANK/RANKL在糖尿病腎病發(fā)病過程中的表達(dá)和作用，目前研究較少。

本實(shí)驗(yàn)建立2型糖尿病腎病動(dòng)物模型，免疫組化和western印跡觀察到對(duì)照組大鼠腎組織中RANK、RANKL表達(dá)量極少，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎臟中RANK及RANKL表達(dá)在4周、8周、12周時(shí)均顯著升高，隨著時(shí)間的推移其陽性表達(dá)明顯增多，且主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，腎間質(zhì)存在少許表達(dá)。另外觀察到模型組蛋白尿明顯增多，腎小球出現(xiàn)輕微硬化，表明發(fā)生了足細(xì)胞的損傷。RANK/RANKL基因表達(dá)可以增加肝臟胰島素抵抗和升高血糖[14]，本研究觀察到模型組腎臟中RANK/RANKL表達(dá)明顯增強(qiáng)，血糖和胰島素抵抗較對(duì)照組明顯升高，相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)RANK表達(dá)與血糖的水平呈明顯正相關(guān)，由此我們猜測(cè)腎臟中RANK/RANKL表達(dá)可能對(duì)胰島素抵抗和血糖的升高存在一定作用。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)RANK表達(dá)量與尿蛋白水平呈明顯正相關(guān)，提示RANK高表達(dá)可能導(dǎo)致蛋白尿的一個(gè)重要因素。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病大鼠腎臟中RANK/RANKL的表達(dá)增加，加重了糖尿病腎病蛋白尿的產(chǎn)生和血糖的升高，可能參與了2型糖尿病腎臟早期的發(fā)病過程，為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制和治療找到了新的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dougall WC,Glaccum M,Charrier K,et al.RANK is essential for osteoclast and lymph node development[J].Genes,1999,13(18):2412.

[2]Kong YY,Yoshida H,Sarosi I,et al.OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis,lymphocyte development and lymph-node organogenesis[J].Nature，1999,397(6717):315.

[3]Dougall WC,Glaccum M,Charrier K,et al.RANK is essential for osteoclast and lymph node development[J].Genes,1999,13(18):2412.

[4]Bucay N,Sarosi I,Dunstan CR,et al.Osteoprotegerin-deficient mice develop early onsetosteoporosis and arterial calcification[J].Genes,1998,12(9):1260.

[5]Tat SK,Pelletier JP,Lajeunesse D,et al.Differential modulation ofRANKL isoforms by human osteoarthritic subchondral boneosteoblasts:influence of osteotropic factors[J].Bone,2008,43(2):284.

[6]劉雙信,王文建，夏運(yùn)風(fēng)，et al.Receptor activator of NF-kappaB and its ligand is a novel raceptor-ligand complex for survival response during podocytes injury[J].中華醫(yī)學(xué)會(huì)腎臟病學(xué)分會(huì)2011學(xué)術(shù)年會(huì),2011:165.

[7]Liu S S，Shi W，Xiao H,et al.Receptor activator of NF-kappaB and podocytes:towards a function of a novel receptor-ligand pair in the survival response of podocyte injury[J].PLoS One,2012,7(7):p.e41331.

[8]Reddy GR,Kotlyarevska K,Ransom RF,et al.The podocyte and diabetes mellitus:Is the podocyte the key to the origins of diabetic nephropathy?[J].Current opinion in nephrology and hypertension,2008,17(1):32.

[9]Bedi S,Vidyasagar A,Djamali A.Epithelial-to-mesenchymal transition and chronic allograft tubulointerstitial fibrosis[J].Transplantation reviews,2008,22(1):1.

[10]李玉山，劉麗秋.實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病腎病大鼠模型研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2009,13(5):574.

[11]馬瑞霞，劉雪梅，劉麗秋等.雷公藤甲素對(duì)2型糖尿病大鼠腎組織足細(xì)胞Nephrin、Podocin蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制[J].中華糖尿病雜志,2010.02(4):291.

[12]TsubakiM,Komai M,Fujimoto S,et al.Activation of NF-kappaB by the RANKL/RANK system up-regulates snail and twist expressions and induces epithelial-to-mesenchymal transition in mammary tumor cell lines[J].J Exp Clin Cancer Res,2013,32:62.

[13]HessE,Duheron V,Decossas M,et al.RANKL induces organized lymph node growth by stromal cell proliferation[J].J Immunol,2012,188(3):1245.

[14]Kiechl S,Wittmann J,Giaccari A,et al.Blockade of receptor activator of nuclear factor-kappaB (RANKL) signaling improves hepatic insulin resistance and prevents development of diabetes mellitus[J].Nat Med,2013,19(3):358.

[15]馮仲林，劉雙信，史 偉,等.嘌呤霉素氨基核苷腎病腎臟中RANK-RANKL的表達(dá)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,(1):65.

[16]劉雙信，史 偉，梁磬苓,等.核因子κB受體活化因子及其配體在5/6腎切除大鼠腎臟中表達(dá)及纈沙坦對(duì)其影響[J].中華腎臟病雜志,2006,22(7):421.