趙玉龍，劉業(yè)兵，石 勇，焦玉蘭，朱秀同，劉 濤，張新新，尤永君，趙麗霞

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司，河北 保定 071000；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

雞毒支原體病是由雞毒支原體（MG）引起雞的一種慢性呼吸道?。–RD）。臨床上主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、呼吸時(shí)發(fā)出羅音等癥狀，感染雞群的免疫力受到抑制，引起肉雞的體重減輕和蛋雞的產(chǎn)蛋率降低，是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。目前對(duì)支原體感染的防治主要在于藥物治療、疫苗預(yù)防及健康畜群的建立，有效的疫苗免疫是防控該病的重要手段。

目前雞毒支原體疫苗生產(chǎn)中，主要應(yīng)用改良Frey氏培養(yǎng)基或其它支原體培養(yǎng)基，所培養(yǎng)的雞毒支原體菌液（半成品）的濃度一般達(dá)到1×108CCU/mL左右，需對(duì)半成品進(jìn)行一定濃縮后方可制備成品疫苗。本研究使用自行改良的雞毒支原體培養(yǎng)基，提高培養(yǎng)菌液濃度到1×1011CCU/mL；同時(shí)使用300KD膜包對(duì)菌液進(jìn)行超濾純化，去除菌液中雜蛋白含量，降低滅活疫苗發(fā)生副反應(yīng)的概率，提高免疫效果。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基

改良 Frey氏培養(yǎng)基按照中國獸藥典的方法進(jìn)行配制；公司改良的雞毒支原體培養(yǎng)基按照專利配方進(jìn)行配制，培養(yǎng)基主要成份PPLO肉湯、葡萄糖、酵母浸出物、豬血清、精氨酸等。

1.2 菌 種

雞毒支原體CR株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 主要試劑

Lowry法蛋白含量檢測試劑盒購自Thermo公司；雞毒支原體ELISA抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；300KD膜包（5塊）購自Millipore公司。

2 方法

2.1 雞毒支原體培養(yǎng)

在實(shí)驗(yàn)室分別應(yīng)用改良Frey氏培養(yǎng)基和公司改良培養(yǎng)基，同時(shí)接種雞毒支原體 CR株菌液進(jìn)行增殖，培養(yǎng)體系3000mL，按照10%接菌量進(jìn)行傳代培養(yǎng)3代，記錄每代生長時(shí)間和測定的菌液CCU值。CCU測定方法按照中國獸藥典的方法進(jìn)行。

2.2 雞毒支原體的純化

取15000 mL雞毒支原體培養(yǎng)菌液，使用300 KD膜包（5塊）先進(jìn)行第一次10×濃縮至1500mL，補(bǔ)充無菌生理鹽水至原體積15000mL；再進(jìn)行10×濃縮至1500mL，補(bǔ)充無菌生理鹽水至原體積15000mL，重復(fù)濃縮洗滌3次；收集每次純化前、10×濃縮滲出液、10×濃縮液和10×濃縮稀釋液進(jìn)行蛋白含量測定和CCU測定。

2.3 制備疫苗及免疫效果評(píng)價(jià)

同時(shí)將純化和未純化的雞毒支原體（菌液濃度均為1×1011CCU/mL）滅活后，按照水油比1：2分別制苗，制備的疫苗免疫3～4周齡SPF雞，免疫后第3周采血分離血清進(jìn)行ELISA抗體檢測，評(píng)價(jià)免疫效果。

3 結(jié)果

3.1 雞毒支原體培養(yǎng)

使用Frey改良培養(yǎng)基最終培養(yǎng)產(chǎn)物CCU值達(dá)1×108；使用公司改良培養(yǎng)基最終培養(yǎng)產(chǎn)物CCU值達(dá)到1×1011，且公司改良培養(yǎng)基增殖速度快于Flury改良培養(yǎng)基3h以上，見表1。

3.2 雞毒支原體的純化

以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度為縱坐標(biāo)（μg/mL）、以吸光度OD750值為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值0.9997，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的OD值，計(jì)算待檢樣品總蛋白濃度，同時(shí)按照CCU測定方法判定樣品CCU結(jié)果，純化過程樣品總蛋白濃度和CCU測定結(jié)果見表2。

雞毒支原體純化前CCU值為1×1011，3次10×濃縮液CCU值均為1×1012，3次10×濃縮稀釋液CCU值均為1×1011，3次10×濃縮滲出液CCU值均為0，表明使用300 KD膜包經(jīng)過3次10×濃縮后，雞毒支原體未見損失。因此判定雞毒支原體不能通過300KD的膜包濾膜，且在本方法濃縮過程中，雞毒支原體抗原含量未發(fā)生變化。

表1 兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)效果對(duì)比

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品OD750值與蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

雞毒支原體純化前蛋白濃度為11307.3μg/mL，使用300KD膜包經(jīng)過一次10×濃縮稀釋，蛋白濃度達(dá)到6056.4μg/mL，雜蛋白去除率為46.4%；經(jīng)過2次10×濃縮稀釋，蛋白濃度達(dá)到2984.7μg/mL，雜蛋白去除率為73.6%；經(jīng)過3次10×濃縮稀釋，蛋白濃度達(dá)到2608.3μg/mL，雜蛋白去除率為76.9%。第2次與第3次雜蛋白去除率相差不大，考慮時(shí)間因素確定純化2次綜合效果要好。

3.3 免疫效果評(píng)價(jià)結(jié)果

未純化（總蛋白含量11307.3μg/mL）與純化2次的雞毒支原體（總蛋白含量2608.3μg/mL）制苗后免疫SPF雞，未純化組免疫后第2～3天部分雞只精神沉郁、采食下降，純化組免疫后精神狀態(tài)良好未見異常；免疫后3周采血檢測ELISA抗體水平，純化組與未純化組所有血清樣品S/P值均大于試劑盒陽性臨界值0.5，全部轉(zhuǎn)陽，但是純化組抗體水平（S/P值）明顯高于未純化組。ELISA抗體檢測結(jié)果見表3。

4 討論

雞毒支原體的生長條件較細(xì)菌苛刻，營養(yǎng)要求也較高，目前常用培養(yǎng)基生產(chǎn)的菌液抗原含量不高，菌液濃度低于1×109CCU/mL，需要進(jìn)行一定倍數(shù)的濃縮。我們根據(jù)雞毒支原體生長特點(diǎn)，調(diào)整現(xiàn)有培養(yǎng)基的成份和含量，研發(fā)出一種改良的雞毒支原體培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到1×1011CCU/mL，顯著提升產(chǎn)品質(zhì)量，降低疫苗生產(chǎn)成本。

表3 疫苗免疫后3周ELISA抗體S/P值檢測結(jié)果

超濾是借助于超濾膜或其他超濾裝置對(duì)生物大分子物質(zhì)進(jìn)行分離、純化及濃縮的一種技術(shù)，該工藝已用于流感疫苗、口蹄疫、狂犬病毒疫苗等疫苗的純化和濃縮，并取得了良好抗原濃縮效果和雜蛋白去除效果。本研究采用300KD膜包、2次10×濃縮-稀釋的方法對(duì)雞毒支原體培養(yǎng)菌液進(jìn)行純化，滲出液CCU測定為0、純化前后CCU值均為1×1011CCU/mL，雞毒支原體在純化過程無滲漏，雜蛋白去除率達(dá)73.6%，提高了抗原的純度，更高效率的純化方法還需進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件。

由于雞毒支原體生長條件苛刻，需要添加高濃度血清和多種營養(yǎng)物質(zhì)，因此制備的疫苗容易引起免疫動(dòng)物的過敏反應(yīng)。通過對(duì)比純化和未純化的抗原制備的疫苗，未純化組雞發(fā)生應(yīng)激，而純化組未見異常，且免疫后3周純化組抗體水平較高，推測是高純度的抗原有利于機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。

本研究解決了雞毒支原體滅活疫苗抗原培養(yǎng)菌液滴度低，成本高的難題，從雞毒支原體抗原生產(chǎn)的培養(yǎng)基和濃縮純化方法兩方面為后續(xù)研究提供了一定思路和方法。

表2 純化過程樣品總蛋白濃度和CCU測定結(jié)果

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