王國(guó)慶，王宗義，馬子夏，馬蒙蒙，翟孟婷，鄭宇

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)是由有機(jī)物不完全燃燒或高溫分解產(chǎn)生的一類食品污染物[1]。由于親脂性強(qiáng)，食用油較易受到PAH的污染，研究顯示，污染最嚴(yán)重的是屈(CHR)，其次是苯并[a]芘(BAP)、苯并[b]熒蒽(BBF)和苯并[a]蒽(BAA)[2]，其中BAP為一級(jí)致癌物，BAA、CHR和BBF為二級(jí)致癌物[3]。目前，我國(guó)規(guī)定食用油中BAP的安全限量為10 μg/kg[4]，對(duì)其他PAH未做限定；而歐盟則相對(duì)更為嚴(yán)格，除規(guī)定BAP的限量為2 μg/kg，還規(guī)定BAP與 BAA、CHR和 BBF四種 PAH的總限量為 10μg/kg[5]。因此，建立簡(jiǎn)便、實(shí)用和相對(duì)快速的食用油中這4種PAH(PAH4)檢測(cè)方法，對(duì)監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)食用油的安全質(zhì)量具有重要意義。

關(guān)于 PAH檢測(cè)方法，主要有高效液相色譜法(HPLC)[6~8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[9,10]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[11,12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[13,14]，也有毛細(xì)管電泳法(CE)[15]和同步熒光光譜法(SFS)[16]的報(bào)道。其中，GC-MS/MS和LC-MS/MS由于具有更為突出的選擇性和檢出能力，在一定程度上降低了樣品前處理方法的難度，成為近年來檢測(cè) PAH更為有效的技術(shù)手段。但就植物油而言，由于目標(biāo)物含量低、以甘油酯為主體的樣品基質(zhì)容易飽和色譜柱、迅速降低柱效和污染離子源，因此，樣品除脂技術(shù)仍然是制約 PHA檢測(cè)的關(guān)鍵，通常需要使用凝膠滲透色譜法[17~19]、固相萃取[20~22]、固相微萃取[23]以及在線凈化技術(shù)[24]等完成。

本研究根據(jù)分子印跡(MIP)材料對(duì)重質(zhì)PAH選擇性保留較好的特點(diǎn)，結(jié)合GC-MS/MS的高靈敏、高選擇性，以CHR-d12、BAP-d12為內(nèi)標(biāo)，建立了正己烷溶樣，MIP固相萃取除脂，GC-MS/MS檢測(cè)，相對(duì)簡(jiǎn)便、快速，用于檢測(cè)食用植物油中4種歐盟限量PAH的新方法，并對(duì)市場(chǎng)食用油樣品進(jìn)行抽樣檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

26個(gè)食用油，購(gòu)自北京地區(qū)超市，包括6個(gè)大豆油、4個(gè)花生油、3個(gè)調(diào)和油、5個(gè)玉米油、2個(gè)葵花油和6個(gè)芝麻油。苯并[a]蒽(BAA)二氯甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 mg/L，1 mL)，屈(CHR)二氯甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 mg/L，1 mL)，苯并[b]熒蒽(BBF)二氯甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 mg/L，1 mL)，苯并[a]芘(BAP)二氯甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 mg/L，1 mL)，CHR-d12二氯甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液(2000 mg/L，1 mL)，BAP-d12甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 mg/L，1 mL)美國(guó)o2si公司；甲醇、正己烷和二氯甲烷(色譜純)美國(guó)J. T. Baker公司。

分子印跡固相萃取柱 Cleanert Bap-3-SPE：500 mg/6 mL、硅膠固相萃取柱Cleanert Silica-SPE：500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890B-7000C氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；BF-2000氮?dú)獯蹈蓛x、CNW12位固相萃取裝置，北京八方世紀(jì)科技有限公司；IKA MS 3 basic渦旋混勻器，德國(guó)IKA公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別將4種定值標(biāo)準(zhǔn)溶液和CHR-d12定值內(nèi)標(biāo)溶液，用二氯甲烷稀釋至10 mL容量瓶中，得到濃度為20 μg/mL的4種混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和濃度為200 μg/mL的CHR-d12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于棕色貯液瓶中-20 ℃儲(chǔ)存；將BAP-d12定值標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋至10 mL容量瓶中，得到濃度為100 μg/mL的BAP-d12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于棕色貯液瓶中-20 ℃儲(chǔ)存。用二氯甲烷稀釋所有標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，得到4種混標(biāo)濃度分別為1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、25 μg/L和50 μg/L，2種內(nèi)標(biāo)濃度為10 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品制備

稱取0.5 g食用油樣品于10 mL離心管中，加入40 μL 0.25 μg/mL BAP- d12 和 40 μL 0.25 μg/mL CHR-d12，加入3 mL正己烷渦旋震蕩溶解，作為待凈化液。

1.4.2 樣品凈化

在 Cleanert Bap-3固相萃取柱上端串聯(lián)一支Cleanert Silica固相萃取柱，依次用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化小柱，將上述待凈化液上樣到小柱上，用2 mL正己烷潤(rùn)洗試管，將潤(rùn)洗液一同上樣到小柱上；先用5 mL正己烷淋洗串聯(lián)柱，待溶液完全滴至Cleanert Bap-3固相萃取柱上，將Cleanert Silica固相萃取柱棄去，再用5 mL正己烷淋洗Cleanert Bap-3固相萃取柱，棄去淋洗液；最后用5 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液。將收集的洗脫液置于 40 ℃下氮吹至 1 mL，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)檢測(cè)。

1.5 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升至280 ℃，保持 6 min；載氣(He，純度>99.999%)流速為 1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為 1 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度為230 ℃，電離模式為電子轟擊離子源(EI)，溶劑延遲時(shí)間為6 min，MSD傳輸線溫度為280 ℃，燈絲電流為35 μA，電子能量為70 eV，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)，參數(shù)見表1。

表1 4種PAH及2種內(nèi)標(biāo)物的MRM參數(shù)Table 1 MRM Parameters of 4 PAHs and 2 internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

圖1 分子印跡固相萃取柱吸附多環(huán)芳烴的效果Fig.1 Recoveries of PAHs on the MIPSPE cartridge

利用GC-MS/MS的高選擇、高靈敏性，雖然植物油樣品經(jīng)簡(jiǎn)單提取即可用于PAH的測(cè)定，但樣品溶液中殘存的甘油酯等基質(zhì)，能快速降低毛細(xì)管色譜柱柱效，縮短使用壽命，并易使離子源受到污染，造成檢測(cè)異常。去除甘油酯為主體的基質(zhì)干擾，固相萃取技術(shù)是較為方便有效的方法之一。常見商品化萃取小柱有中性氧化鋁柱[8]、弗羅里硅土柱[10]、活性炭柱[22]和分子印跡柱[25]。其中，中性氧化鋁柱和弗羅里硅土柱是利用其對(duì)樣品溶液油脂和色素的吸附保留，進(jìn)行凈化，但由于植物油樣品的主體為油脂，填料和洗脫溶劑體積用量較大；而活性炭柱和分子印跡柱則是選擇吸附待測(cè)物，除脂較為完全，洗脫溶劑用量少，操作簡(jiǎn)單；但活性炭柱大多適用于輕質(zhì) PAH，重質(zhì) PAH則容易被永久吸附，回收率偏低[22]，而商品化 BAP分子印跡柱（見1.1），除對(duì)BAP有選擇性保留外，對(duì)包括BAA、CHR和BBF在內(nèi)的幾種重質(zhì)PAH均有滿意的選擇性保留。見圖1，為GB 5009.265-2016中涉及的16種PAH在本實(shí)驗(yàn)條件下，BAP分子印跡柱上的保留效果。因此本文選用BAP分子印跡柱進(jìn)行凈化。

植物油樣品用正己烷溶解，當(dāng)流經(jīng)分子印跡凈化柱后，目標(biāo)物被選擇性吸附，再用適量正己烷清洗殘留油脂后，目標(biāo)PAH可通過誘導(dǎo)偶極-偶極相互作用被極性溶劑洗脫，本文選用極性、揮發(fā)性適中的二氯甲烷做洗脫溶劑，即容易吹干，又方便控制體積，當(dāng)洗脫體積為5 mL時(shí)4種目標(biāo)PAH被完全洗脫。為進(jìn)一步去除復(fù)雜植物油樣品（如芝麻油）中有機(jī)酸、多酚類物質(zhì)的干擾，分子印跡柱上方與硅膠柱進(jìn)行串聯(lián)使用，洗脫前棄去硅膠柱，能更好地去除基質(zhì)干擾。實(shí)驗(yàn)表明，使用BAP分子印跡柱，凈化植物油樣品，簡(jiǎn)單有效。

2.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖2 4種PAH的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 4 PAHs

由于BAA與CHR為同分異構(gòu)體，BBF與BKF為同分異構(gòu)體，質(zhì)譜母離子和子離子相同，無(wú)法通過質(zhì)譜進(jìn)行區(qū)分，因此，必須使BAA與CHR進(jìn)行有效色譜分離，BBF不受BKF色譜峰的干擾。常用分離PAH的毛細(xì)管色譜柱主要有DB-5MS[10]、HP-5MS[11]和DB-EUPAH[22]，其中DB-EUPAH為PAH專用柱，適于分離較多種PAH。本研究由于只測(cè)定BAA、CHR、BBF和BAP四種PAH，選擇使用DB-5MS毛細(xì)管色譜柱，在本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件下，BAA與 CHR、BBF與BKF獲得了良好分離。質(zhì)譜參數(shù)根據(jù)樣品基質(zhì)的干擾情況對(duì)母離子、子離子和碰撞能進(jìn)行了選擇和優(yōu)化，MRM參數(shù)及MRM色譜圖分別見表1和圖2。

2.3 檢出限(LOD)、定量限(LOQ)、線性、準(zhǔn)確度和精密度

LOD和LOQ分別是目標(biāo)物定量離子色譜峰不小于3倍和10倍的信噪比(Peak to Peak)，且定性離子色譜峰可有效識(shí)別，通過對(duì)適當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液、實(shí)際樣品和空白加標(biāo)樣進(jìn)行測(cè)定進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果見表 2。儀器 LOD 為 0.03~0.09 μg/L，LOQ 為 0.13~0.29 μg/L，方法LOD為0.26~0.49 μg/kg，LOQ為0.86~1.63 μg/kg，能滿足4種歐盟限量PAH監(jiān)測(cè)的需要；在1~50 μg/L濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)物均有良好的線性，R2>0.999，詳見表2；對(duì)食用油樣品進(jìn)行5、10和20 μg/kg三個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，回收率為 81.06~111.30%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.86~5.65%，詳見表3。

表2 4種PAH的線性、檢出限與定量限Table 2 Linearity, LOD and LOQ of 4 PAHs

表3 4種PAH的回收率(R)和精密度(RSD)(n=6)Table 3 Recovery rate (R) and relative standard deviation (RSD) of 4 PAHs (n=6)

2.4 實(shí)際樣品的分析

采用上述所建立的方法，對(duì)26個(gè)市售食用植物油進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定兩次，結(jié)果見表 4。由表4可知，4種PAH均有檢出；其中，BAP的含量為2.04~6.16 μg/kg，低于我國(guó)食用油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量[4]，但超出歐盟限量[5](超標(biāo)率為 100%)。BAA 含量為2.22~7.38 μg/kg，CHR 含量為 2.72~10.90 μg/kg，BBF含量為 2.38~7.58 μg/kg，PAH4總含量為 9.36~31.38μg/kg，其中23個(gè)市售食用植物油的4種PAH總含量超出歐盟限量[5](超標(biāo)率為88.46%)。監(jiān)測(cè)的6種油品間，PAH4平均含量相對(duì)較高的是芝麻油、花生油和葵花油，較低的是大豆油、玉米油和調(diào)和油。依相關(guān)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)食用油中的 PAH處于安全水平，但較歐盟限量而言，我國(guó)食用植物油的安全質(zhì)量還存在較大差距，有待一步的提高。

表4 實(shí)際樣品中4種PAH的含量(μg/kg)Table 4 The contents of 4 PAHs in edible vegetable oil samples (μg/kg)

3 結(jié)論

本研究建立了分子印跡固相萃取除脂，GC-MS/MS檢測(cè)食用植物油中4種歐盟限量PAH的新方法。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)，能滿足對(duì)食用油中4種歐盟限量PAH監(jiān)測(cè)的需要。

[1]Lee M L, Novotny M V, Bartle K D. Analytical chemistry of polycyclic aromatic compound [M]. Amsterdan: Academic Press, 1981

[2]曹夢(mèng)思,王君,張立實(shí),等.我國(guó)食用油脂中歐盟優(yōu)控15+1種多環(huán)芳烴的污染狀況分析[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2016,16(12):198-205 CAO Meng-si, WANG Jun, ZHANG Li-shi, et al. Analysis of EU 15+1 PAHs pollution in edible fats and oils of china [J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2016, 16(12): 198-205

[3]Alicja Z, Dorota G, Leslaw J. Method validation and determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in vegetable oils by HPLC-FLD [J]. Food Analytical Methods,2017, 10: 1078-1086

[4]GB 2762-2017,《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》[S]GB 2762-2017, National food safety standards in food contaminants [S]

[5]NO 835/2011, Maximum levels for polycyclic aromatic hydrocarbons in foodstuffs [S]

[6]Mansour M, Javad M, Mir-Michael M, et al. Application of the microwave-assisted extraction and dispersive liquid-liquid microextraction for the analysis of PAHs in smoked rice [J]. Food Analytical Methods, 2017, 10: 277-286

[7]王廣會(huì),許喜林,郭海英.高效液相色譜法測(cè)定芝麻油中的苯并[a]芘含量[J].現(xiàn)代食品科技,2011, 27(12):1545-1547 WANG Guang-hui, XU Xi-lin, GUO Hai-ying.Determination of benzo(a)pyrene residue in sesame oil by HPLC [J]. Modern Food Science and Technology, 2011,27(12): 1545-1547

[8]馮寅潔,喬勇升,陳偉,等.固相萃取-超高效液相色譜熒光法檢測(cè)植物油中苯并[a]芘[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào),2015,41(2):189-194 FENG Yin-jie, QIAO Yong-sheng, CHEN Wei, et al.Determination of benzo(a)pyrene in vegetable oil by solid phase extraction-ultra performance liquid chromatographyfluorescence detector [J]. Journal of Zhejiang University,2015, 41(2): 189-194

[9]王珍,王琳琳,陳小鵬,等.超聲波輔助-DMC 萃取食用油中苯并[a]芘及其GC/MS分析[J].廣西大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,38(3):538-543 WANG Zhen, WANG Lin-lin, CHEN Xiao-peng, et al.Ultrasound assisted extraction with environmental friendly solvent for the determination of benzo(a)pyrene in edible oil by GC/MS [J]. Journal of Guangxi University, 2013, 38(3):538-543

[10]GB 5009.265-2016,《食品中多環(huán)芳烴的測(cè)定》[S]GB 5009.265-2016, The determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in food [S]

[11]RUIZE Z, JIE J, TING M, et al. Multiresidue analysis of environmental pollutants in edible vegetable oils by gas chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Food Chemistry, 2016, 207: 43-50

[12]李晨悅,周金林,黃金鳳,等.GC-MS/MS法檢測(cè)山茶油中的苯并[a]芘[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(7):1702-1705 LI Chen-yue, ZHOU Jin-lin, HUANG Jin-feng, et al.Determination of benzo (a) pyrene in camelia oil by GC-MS/MS [J]. Modern Food Science and Technology, 2013,29(7): 1702-1705

[13]石龍凱,劉玉蘭.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食用油脂中多環(huán)芳烴[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2015,30(12):114-119 SHI Long-kai, LIU Yu-lan. Simultaneous determination of PAHs in edible oils by liquid chromatography tandem mass spectrometry [J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2015, 30(12): 114-119

[14]Longkai S, Yulan L, Huamin L, et al. One-step solvent extraction followed by liquid chromatography-atmospheric pressure photoionization tandem mass spectrometry for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oils [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407:3605-3616

[15]Ludivine F, Nathalie D, Douglas N R, et al. Optimizing separation conditions of 19 polycyclic aromatic hydrocarbons by cyclodextrin-modified capillary electrophoresis and application to edible oils [J]. Talanta, 2014, 119: 572-581

[16]Yihong L, Pingping W, Qian L, et al. A simple fluorescence spectroscopic approach for simultan and rapid detection of four polycyclic aromatic hydrocarbons(PAH4)in vegetable oils [J]. Food Analytical Methods, 2016, 9(11): 3209-3217

[17]Jianhua W, Cui G. Ultrasonication extraction and gel permeation chromatography clean-up for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oil by an isotope dilution gas chromatography mass spectrometry [J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(28): 4732-4737

[18]Fromberg A, Hojgard A, Duedahlo. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in vegetable oils combining gel permeation chromatography with solid-phase extraction clean-up [J]. Food Additives and Contaminants, 2007, 24(7):758-767

[19]王建華,郭翠,龐國(guó)芳,等.GPC 凈化-同位素稀釋內(nèi)標(biāo)定量GC-MS對(duì)植物油中多環(huán)芳烴的測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2009,28(3):267-271 WANG Jian-hua, GUO Cui, PANG Guo-fang, et al.Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAH4)in vegetable oil samples by gel permeation chromatography purification-gas chromatography-mass spectrometry based on an isotope dilution approach [J]. Journal of Instrumental Analysis, 2009, 28(3): 267-271

[20]Dafeng J, Chenglong X, Wei L, et al. Quantitative analysis and health risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons in edible vegetable oils marketed in Shandong of China [J]. Food and Chemical Toxicology, 2015, 83: 61-67

[21]尹佳,余瓊衛(wèi),趙琴,等.固相萃取-高效液相色譜法聯(lián)用測(cè)定食用油中的4種多環(huán)芳烴[J].中國(guó)油脂,2015,40(3):52-56 YIN Jia, YU Qiong-wei, ZHAO Qin, et al. Determination of four polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oils by solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography [J]. China Oils and Fats, 2015, 40(3): 52-56

[22]許婷,湯樺,陳大舟,等.同位素稀釋-氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法分析食用油中 18種多環(huán)芳烴[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2015,36(2):120-127 XU Ting, TANG Hua, CHEN Da-zhou, et al. Determination of 18 polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oils by isotope dilutionGC-MS/MS [J]. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2015, 36(2): 120-127

[23]Giorgia P, Massimo P, Laura B, et al. Direct-immersion solid-phase microextraction coupled to fast gas chromatography mass spectrometry as a purification step for polycyclic aromatic hydrocarbons determination in olive oil[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1307: 166-171

[24]王春蕾,劉華良,馬永建,等.在線固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)食用油中 15+1種歐盟優(yōu)控多環(huán)芳烴[J].分析化學(xué)研究報(bào)告,2015,43(11):1743-1748 WANG Chun-lei, LIU Hua-liang, MA Yong-jian, et al.Determination of 15+1 European priority polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oil by online solid phase extraction and high performance liquid chromatography [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(11): 1743-1748

[25]王桂苓.高效液相色譜法測(cè)定食用植物油中苯并[a]芘的研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2015,6(12):5006-5010 WANG Gui-ling. Determination of benzo(a)pyrene in edible vegetable oil by high performance liquid chromatography [J].Journal of Food Safety and Quality, 2015, 6(12): 5006-5010

[26]Shimin W, Wenjuan Y. Liquid-liquid extraction of polycyclic aromatic hydrocarbons in four different edible oils from china[J]. Food Chemistry, 2012, 134: 597-601