李維，崔丹瑤，王建輝，張翠英，肖冬光

（天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細(xì)胞真核生物，是人類接觸和應(yīng)用最早的微生物，在食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1]。在釀酒工業(yè)的發(fā)酵過(guò)程中，釀酒酵母將進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖等單糖在酶的作用下，轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳等成分[2]。釀酒工業(yè)是全球很多國(guó)家和地區(qū)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展中扮演著重要的角色。我國(guó)是最早擁有釀造制酒技術(shù)的國(guó)家之一，至今已有數(shù)千年。白酒是我國(guó)特有的蒸餾酒，在釀造過(guò)程中，以酵母菌、霉菌等自然微生物制作酒曲（大曲、小曲和米曲等）作為發(fā)酵劑是我國(guó)釀酒技術(shù)領(lǐng)域的重大發(fā)明之一[3]。

白酒的主要成分是水和乙醇，由酒曲微生物代謝、原料分解及化學(xué)反應(yīng)生成的風(fēng)味物質(zhì)雖然占比只有1%～2%，但決定著酒的品質(zhì)和風(fēng)格。目前白酒可檢測(cè)到的微量成分有300多種，除極少量的無(wú)機(jī)化合物之外，均是具有揮發(fā)性的有機(jī)化合物[4,5]。根據(jù)化學(xué)屬性，白酒中的風(fēng)味物質(zhì)可分為酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、內(nèi)酯類、吡嗪類、芳香族和呋喃類等[6]。這些化合物所具有的特定的呈香呈味基團(tuán)，互相補(bǔ)充、配合、襯托、制約，構(gòu)成了不同香型和風(fēng)格白酒的典型特征[7]。風(fēng)味物質(zhì)中，高級(jí)醇主要由釀酒酵母在釀造的主發(fā)酵時(shí)間段生成[8,9]。適量的高級(jí)醇可以賦予酒特殊的香氣，使口感豐滿柔和，圓潤(rùn)醇厚，給人愉快舒適的感覺[10]；若濃度過(guò)高，則有令人不快的雜異味，并且飲用后容易“上頭”，危害人體健康[11]。酯類物質(zhì)來(lái)自酵母的生物合成、酒曲中酯化酶的催化合成以及貯藏陳釀過(guò)程中的酯化反應(yīng)[12～14]。酯普遍具有果香味，且閾值較低，對(duì)各種酒類風(fēng)味典型性的形成有著關(guān)鍵的作用[15]。如何將酒中高級(jí)醇的含量控制在合適的范圍內(nèi)，將酯的含量在合適的范圍內(nèi)提高，是釀酒行業(yè)一直關(guān)注的課題[14,16]。

本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）檢測(cè)由不同的高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母參與發(fā)酵的酒中的風(fēng)味成分，比較它們對(duì)酒風(fēng)味形成的差異，并采用氣相色譜對(duì)其中主要的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析，旨在研究這幾株釀酒酵母對(duì)酒中高級(jí)醇和酯含量的影響，為其實(shí)際應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：釀酒酵母工業(yè)菌株AY15（CICC32315）、低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母菌株AY15-BAT2[17]、高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母菌株 AY15-BAT2+ATF1[17]和AY15-IAH1+ATF1[17]，均由天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

材料：濃香大曲、高粱粉，某濃香型白酒廠提供；玉米粉，市售；液化酶、糖化酶，來(lái)自諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司。

試劑：乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸正戊酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙酸、丁酸、己酸（均為色譜純），來(lái)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、7890A氣相色譜儀、G4512A自動(dòng)進(jìn)樣器，來(lái)自美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、固相微萃取（SPME）手柄，來(lái)自美國(guó)Supelco公司；IT-09A恒溫磁力加熱攪拌器，來(lái)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白酒發(fā)酵

將高粱粉碎，60%以上通過(guò)20目篩孔；500 mL三角瓶稱取高粱80 g，加入到200 mL 60 ℃水中，加入液化酶 20 μL，加熱至 85～90 ℃，維持 1 h；115 ℃滅菌30 min，冷卻至60 ℃，加入糖化酶40 μL，維持30 min；冷卻至40 ℃，加酸性蛋白酶，維持30 min；冷卻至30 ℃，加入大曲20 g，加脂肪酶0.08 g，接酵母（細(xì)胞數(shù)500萬(wàn)/mL），總體積補(bǔ)充至300 mL，攪拌均勻；30 ℃靜置發(fā)酵，48 h添加己酸（500 mg/L）；發(fā)酵5 d，將三瓶發(fā)酵醪合并蒸餾，蒸餾至酒度為50%(V/V)。

1.3.2 萃取[18]

將酒樣稀釋至12% (V/V)，取8 mL置于20 mL螺口頂空樣品瓶，加3 g氯化鈉，放入磁性轉(zhuǎn)子，用聚四氟乙烯將瓶口緊密封好。樣品在恒溫磁力攪拌器中60 ℃平衡 10 min，將萃取頭插入瓶?jī)?nèi)頂空吸附 40 min。萃取后將萃取頭插入GC-MS系統(tǒng)進(jìn)樣口，250 ℃解吸附5 min。

1.3.3 GC-MS條件[18]

氣相色譜條件：色譜柱為 Agilent CP-Wax（60 m×0.25 mm×0.5 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流；載氣氦氣流速為0.8 mL/min；升溫程序?yàn)槠鹗?0 ℃維持2 min，按照2 ℃/min的速度升到100 ℃，再按照4 ℃/min的速度升到230 ℃，維持3 min。

質(zhì)譜條件：EI；70 eV；掃描范圍30～500 u；離子源溫度230 ℃。

1.3.4 GC條件[17]

檢測(cè)條件：檢測(cè)器為 FID，色譜柱為 Agilent 1909N-213（30 m×320 μm×0.5 μm），高純度氮?dú)廨d氣流速設(shè)置為2 mL/min，進(jìn)樣口溫度為200 ℃，檢測(cè)器溫度為200 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為10：1。起始色譜柱溫度為50 ℃并維持8 min，然后按照5 ℃/min的速度提升到120 ℃，維持5 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性：GC-MS的結(jié)果經(jīng)NIST08譜庫(kù)進(jìn)行定性分析，對(duì)樣品中各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算，利用面積歸一法。

定量：以乙酸正戊酯作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)樣品中含量較多的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定及分析

在 AY15、AY15-BAT2、AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1參與發(fā)酵的酒樣中分別鑒定出62、56、63、59種揮發(fā)性成分，結(jié)果如表1。

圖1 AY15酒樣揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 TIC of volatile components in liquor sample by AY15

圖2 AY15-BAT2酒樣揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 TIC of volatile components in liquor sample by AY15-BAT2

圖3 AY15-BAT2+ATF1酒樣揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.3 TIC of volatile components in liquor sample by AY15-BAT2+ATF1

圖4 AY15-IAH1+ATF1酒樣揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.4 TIC of volatile components in liquor sample by AY15-IAH1+ATF1

在白酒發(fā)酵過(guò)程中，分別添加釀酒酵母野生菌株AY15和擁有不同高級(jí)醇和酯生成能力的釀酒酵母菌株 AY15-BAT2、AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1，對(duì)其發(fā)酵后蒸餾得到的酒樣進(jìn)行HS-SPME-GC-MS檢測(cè)分析，總離子流色譜圖（total ion chromatogram，TIC）見圖1、2、3和4。

有AY15參與發(fā)酵的酒樣主要揮發(fā)性成分有42種酯類、除乙醇外6種醇類、2種醛類、3種酸類、5種烷烴、1種芳香烴、1種酚類和1種萜類。其中，酯醇酸醛四大類物質(zhì)的含量分別占總揮發(fā)性成分的60.90%、6.32%、0.08%和2.62%，其它物質(zhì)的含量占揮發(fā)性成分的0.60%。有AY15-BAT2參與發(fā)酵的酒樣主要揮發(fā)性成分有36種酯類、除乙醇外7種醇類、1種醛類、3種酸類、5種烷烴、1種酮類、1種酚類、1種萜類。其中，酯醇酸醛四大類物質(zhì)的含量分別占總揮發(fā)性成分的54.35%、4.62%、0.04%和2.14%，醇類物質(zhì)的相對(duì)含量相比AY15降低了26.93%；其它物質(zhì)的含量占揮發(fā)性成分的0.65%。

有 AY15-BAT2+ATF1參與發(fā)酵的酒樣主要揮發(fā)性成分有44種酯類、除乙醇外5種醇類、1種醛類、3種酸類、5種烷烴、1種芳香烴、1種酮類、1種酚類、1種萜類。其中，酯醇酸醛四大類物質(zhì)的含量分別占總揮發(fā)性成分的67.15%、4.28%、0.03%和2.19%，酯類物質(zhì)的相對(duì)含量相比AY15提高了10.27%，醇類物質(zhì)的相對(duì)含量相比AY15降低了32.30%；其它物質(zhì)的含量占揮發(fā)性成分的 0.45%。與 AY15相比，AY15-BAT2+ATF1樣品中新檢出乙酸正丁酯、乙酸庚酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸-甲氧基-2-苯乙酯五種乙酸酯。有AY15-IAH1+ATF1參與發(fā)酵的酒樣主要揮發(fā)性成分有42種酯類、除乙醇外6種醇類、1種醛類、3種酸類、3種烷烴、1種芳香烴、1種酚類、1種萜類。其中，酯醇酸醛四大類物質(zhì)的含量分別占總揮發(fā)性成分的68.21%、4.50%、0.04%和1.90%，酯類物質(zhì)的相對(duì)含量相比AY15提高了12.01%，醇類物質(zhì)的相對(duì)含量相比AY15降低了28.73%；其它物質(zhì)的含量占揮發(fā)性成分的 0.35%。與 AY15相比，AY15-IAH1+ATF1樣品中新檢出乙酸正丁酯、乙酸辛酯兩種乙酸酯。

表1 揮發(fā)性成分在不同釀酒酵母菌株酒樣中的相對(duì)含量Table 1 Relative contents of volatile components in liquor samples by different yeast strains

3 1 4 7.2 3 己酸己酯 0.6 3 0.8 4 0.4 1 0.6 2 3 2 4 8.8 5 辛酸3-甲基丁酯 - 0.2 9 0.1 3 0.2 0 3 3 4 9.1 7 反式-4-癸烯酸乙酯 0.0 4 0.2 9 0.0 3 0.0 4 3 4 4 9.5 8 丁二酸二乙酯 0.5 5 0.3 9 0.4 8 0.3 3 3 5 4 9.7 2 苯甲酸乙酯 0.0 8 0.0 8 0.0 6 0.0 6 3 6 4 9.9 4 9-癸烯酸乙酯 0.1 2 - 0.0 7 -3 7 5 0.9 0 癸酸正丙酯 - - - 0.0 2 3 8 5 1.3 1 4,8,1 2-三甲基-癸酸乙酯 0.0 5 0.0 7 - 0.0 4 3 9 5 1.4 3 十一酸乙酯 0.1 7 0.1 4 0.0 9 0.1 2 4 0 5 3.2 8 苯乙酸乙酯 0.1 3 0.1 5 0.1 0 0.0 8 4 1 5 4.2 1 乙酸苯乙酯 - - 0.2 1 -4 2 5 4.5 2 月桂酸乙酯 - - 2.7 1 2.9 8 4 3 5 6.1 8 3-苯丙酸乙酯 1.6 6 1.6 7 1.3 3 1.1 3 4 4 5 7.2 1 十三酸乙酯 0.0 6 0.0 7 0.0 3 0.0 3 4 5 5 8.1 7 油酸乙酯 0.5 0 0.4 9 0.2 4 0.6 1 4 6 5 9.8 7 十四酸乙酯 1.6 7 1.4 5 1.2 2 1.0 2 4 7 6 0.9 6 己酸苯乙酯 - - - 0.0 1 4 8 6 1.2 9 亞油酸乙酯 0.4 2 0.5 5 0.2 7 0.4 7 4 9 6 1.4 9 辛二酸二乙酯 0.0 7 - - -5 0 6 2.3 3 1 3-甲基十四酸乙酯 - 0.0 7 - 0.1 1 5 1 6 2.3 4 十五酸乙酯 0.2 3 0.2 1 0.1 2 -5 2 6 3.3 5 乙酸-甲氧基-2-苯乙酯 - - 0.2 8 -5 3 6 3.3 6 己酸-2-苯乙酯 0.6 1 0.7 8 - 0.5 1 5 4 6 4.7 7 棕櫚酸乙酯 4.7 0 3.7 1 2.8 1 2.1 1 5 5 6 5.2 6 9-十六碳烯酸乙酯 0.3 4 0.4 1 0.2 4 0.1 8 5 6 6 5.2 7 E-1 1-十六碳烯酸乙酯 0.1 7 - - -5 7 6 6.4 5 9,1 2-十六碳二烯酸乙酯 0.1 0 0.0 9 0.0 2 -5 8 6 7.2 1 1 4-甲基十六酸乙酯 0.0 1 0.0 1 - -醇類5 9 1 1.6 7 乙醇 1 3.1 2 1 2.0 3 1 3.2 5 1 3.3 6 6 0 1 6.8 0 正丙醇 0.0 8 0.0 6 - -6 1 1 9.9 7 異丁醇 1.1 0 0.5 9 0.5 2 0.6 0 6 2 2 3.1 2 正丁醇 0.0 4 0.0 3 - 0.0 4 6 3 2 7.3 4 異戊醇 4.4 6 3.3 2 3.2 2 3.3 4 6 4 3 6.3 4 正己醇 0.4 2 0.3 3 0.3 5 0.3 0 6 5 4 8.0 2 三十烷醇 - - 0.0 1 -6 6 5 2.1 4 油醇 - - - 0.0 5 6 7 5 7.0 4 苯乙醇 0.2 1 0.2 3 0.1 8 0.1 8 6 8 5 7.8 1 十二硫醇 - 0.0 5 - -醛類6 9 4 2.2 0 糠醛 0.0 2 - - -7 0 4 4.7 2 苯甲醛 0.0 5 0.0 4 0.0 3 -7 1 5 1.1 2 E-1 4-十六烷烯醛 - - - 0.0 4

注：“-”表示未檢出。

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定量分析

對(duì)酒樣中含量較多的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行GC定量分析，結(jié)果見表2。

表2 不同釀酒酵母酒樣中主要揮發(fā)性成分定量分析結(jié)果Table 2 Quantitative analysis results of main volatile components in liquor samples by different yeast strains

2.2.1 酯類物質(zhì)

酯類物質(zhì)是白酒中含量最多的風(fēng)味物質(zhì)之一，是酒中香氣的主要來(lái)源[15]。有 AY15-BAT2參與發(fā)酵酒樣的乙酸乙酯與乙酸異戊酯相比 AY15沒(méi)有顯著差異。有AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1參與發(fā)酵酒樣的乙酸乙酯與乙酸異戊酯則有顯著提高，乙酸乙酯生成量分別為1559.43 mg/L和1598.89 mg/L，相比AY15提高90.39%和95.21%；乙酸異戊酯生成量分別為12.96 mg/L和15.40 mg/L，相比AY15提高108.39%和147.55%。其它的主要酯類物質(zhì)丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯，四株釀酒酵母之間沒(méi)有明顯區(qū)別。結(jié)果表明高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級(jí)醇的兩株釀酒酵母可以在不影響其它主要酯含量的情況下，顯著提高酒中主要乙酸酯的含量；低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母不影響主要酯類物質(zhì)的生成。

2.2.2 高級(jí)醇

高級(jí)醇不僅襯托出酯香，還使口感豐滿柔和，圓潤(rùn)醇厚[10]，但若其濃度過(guò)高，則有令人不快的雜異味，并且飲用后容易“上頭”[11]。有 AY15-BAT2、AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1參與發(fā)酵酒樣的正丙醇、異丁醇和異戊醇相比AY15均有顯著減少且程度各不相同：AY15-BAT2樣品中三種高級(jí)醇的含量分別降低了 9.2%、44.13%和 18.72%，AY15-BAT2+ATF1樣品中三種高級(jí)醇的含量分別降低了 14.67%、58.69%和 30.96%，AY15-IAH1+ATF1樣品中三種高級(jí)醇的含量分別降低了15.06%、32.84%和25.95%。結(jié)果表明三種釀酒酵母在白酒發(fā)酵過(guò)程中具有不同的高級(jí)醇生成能力，結(jié)合其不同的乙酸酯生成能力，使得最終得到的酒樣中的酯與高級(jí)醇的比例有不同程度的提高。

2.2.3 酸類物質(zhì)

酸類物質(zhì)是形成口感和味道的重要成分，也是形成酯的前體物質(zhì)，對(duì)酒的后味起到平衡和協(xié)調(diào)的作用[19]。有AY15-BAT2、AY15-BAT2+ATF1、AY15-IAH1+ATF1參與發(fā)酵酒樣的乙酸、丁酸、己酸相比 AY15均沒(méi)有顯著差異。結(jié)果表明三株釀酒酵母菌株在改變酯與高級(jí)醇含量比例的情況下，對(duì)酸類物質(zhì)的含量沒(méi)有明顯影響。

3 結(jié)論

采用 HS-SPME-GC-MS檢測(cè)由不同的高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母參與發(fā)酵白酒中的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)酯與高級(jí)醇的比例相比野生菌株均有不同程度的提高。其中，AY15-BAT2+ATF1樣品中新檢出乙酸正丁酯、乙酸庚酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯、乙酸-甲氧基-2-苯乙酯五種乙酸酯，AY15-IAH1+ATF1樣品中新檢出乙酸正丁酯、乙酸辛酯兩種乙酸酯。對(duì)酒樣中的主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析，兩株高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母在不影響其它主要酯含量的情況下，顯著提高乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量；低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母則不影響主要酯類物質(zhì)的生成。三種釀酒酵母不同程度的降低了酒中正丙醇、異丁醇和異戊醇的含量，結(jié)合其不同的乙酸酯生成能力，最終不同程度的提高了酯與高級(jí)醇的比例。研究結(jié)果為這三株高產(chǎn)酯低產(chǎn)高級(jí)醇釀酒酵母在工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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