王 健，徐曄曄，于 潔，張 旭，王喜波*，江連洲

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）由于其良好的功能性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及潛在的健康益處而一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，并被廣泛應(yīng)用于食品的多個(gè)領(lǐng)域[1-3]。蛋白質(zhì)的柔性可以理解為蛋白質(zhì)所處外部環(huán)境變化時(shí)，其結(jié)構(gòu)能夠發(fā)生改變的能力，反映出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境變化的敏感性[4-6]。因其在決定蛋白功能性質(zhì)尤其是界面性質(zhì)中的關(guān)鍵作用而受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。Tang Chuanhe等[7]研究牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，柔性越高的蛋白越易在界面形成更好的黏彈性蛋白膜，從而表現(xiàn)出更好的乳化性質(zhì)。Kato等[8]利用不同蛋白對(duì)胰蛋白的敏感性來(lái)表征柔性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)起泡性、乳化性與蛋白柔性具有較好的相關(guān)性。Tang Chuanhe[6]、Nakai[9]等認(rèn)為相比于表面疏水性，蛋白柔性在決定SPI乳化性時(shí)起著更為決定性的作用。江連洲[10]總結(jié)現(xiàn)有食用蛋白質(zhì)加工技術(shù)，首次提出蛋白質(zhì)柔性化加工技術(shù)概念，即通過(guò)物理、化學(xué)及生物等加工方式改變蛋白質(zhì)天然的剛性結(jié)構(gòu)，使其柔性化，從而提高蛋白的功能性質(zhì)。雖然柔性在蛋白質(zhì)功能性質(zhì)中的作用得到廣泛的關(guān)注[11-13]，但用胰蛋白酶的敏感性表征蛋白柔性來(lái)研究柔性與蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)系還鮮有報(bào)道。

柔性蛋白比剛性蛋白對(duì)胰蛋白酶更加敏感[8]，本實(shí)驗(yàn)利用SPI對(duì)胰蛋白酶的敏感性表征柔性，研究不同熱處理?xiàng)l件對(duì)SPI柔性與結(jié)構(gòu)的影響，并分析它們之間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步研究柔性在SPI結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供；三氯乙酸永華精細(xì)化學(xué)品有限公司；十二烷基硫酸鈉、Tris、胰蛋白酶、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）熒光探針 美國(guó)Sigma公司；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國(guó)Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T18 Basic型高速分散機(jī)/勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；LD4-2A低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；TU-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；ALC-310.3型分析天平 德國(guó)艾科勒公司；紫外分光光度計(jì) 美國(guó)布魯克海文儀器公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋 賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 SPI制備

參照Sorgentini等[14]方法并略作改動(dòng)。大豆粉碎后過(guò)60 目篩，乙醚低溫脫脂，脫脂后豆粕與蒸餾水以1∶10（m/V）的比例混合，調(diào)pH值至8.5，室溫低速攪拌2 h溶解。4 000×g離心20 min，取上清液，調(diào)pH值至4.5，4 ℃靜置過(guò)夜，去上清液，4 000×g離心5 min，水洗沉淀，離心兩次，復(fù)溶后調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥。

1.3.2 SPI成分測(cè)定

蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法；水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法；灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：GB 5009.4-2010《食品中灰分的測(cè)定》；粗脂肪的測(cè)定：GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的測(cè)定》。

1.3.3 樣品制備

將SPI溶于緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液），質(zhì)量濃度為20 mg/mL，室溫?cái)嚢? h，再用分散機(jī)10 000 r/min處理1 min，水化過(guò)夜。

1.3.4 熱處理

將制備好的SPI樣品在不同溫度60、70、80、90、100 ℃（水浴）、121 ℃（滅菌鍋）下處理5、10、30 min，迅速用冰水冷卻5 min備用。

1.3.5 柔性測(cè)定

參照Kato等[15]的方法略作修改。利用SPI對(duì)胰蛋白酶的敏感性來(lái)表征并量化柔性。取250 μL 1 mg/mL胰蛋白酶（溶于0.05 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液）溶液加入到4 mL 1 mg/mL熱處理后蛋白溶液中（V（蛋白）：V（酶）＝16∶1），38 ℃保溫酶解5 min，酶解反應(yīng)結(jié)束后，加4 mL 體積分?jǐn)?shù)5% 三氯乙酸溶液終止酶解反應(yīng)，離心后取上清液測(cè)定其在280 nm波長(zhǎng)處吸光度，用吸光度A0表示柔性。

1.3.6 濁度測(cè)定

濁度的測(cè)定參照Kurganov等[16]的方法，并略作改動(dòng)，將熱處理后的SPI樣品溶液用去離子水稀釋至3 mg/mL，混合均勻后于400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，即為濁度值。

1.3.7 游離巰基含量測(cè)定

游離巰基的含量測(cè)定參照Beveriger等[17]的方法，并略作改動(dòng)。取1 mL不同熱處理后SPI樣品（10 mg/mL）加入到5 mL的Tris-Gly緩沖溶液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）中，然后加入20 μL DTNB試劑，振蕩混勻，在室溫下靜止反應(yīng)15 min，412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以不加DTNB的溶液做空白調(diào)零。游離巰基含量按下式計(jì)算。

式中：A412nm為412 nm波長(zhǎng)處的吸光度；ρ為固形物質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋系數(shù)。

1.3.8 表面疏水性測(cè)定

參照Hayakawa等[18]方法并略作改動(dòng)。用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將SPI樣品溶液稀釋到0.100 00、0.050 00、0.002 50 mg/mL和0.001 25 mg/mL，然后加入20 μL的ANS（8 mmol/L，溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）熒光探針，混勻后在室溫下避光15 min后測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，狹縫寬度5 nm，測(cè)得的熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白溶液質(zhì)量濃度作圖，選擇線(xiàn)性關(guān)系良好的回歸曲線(xiàn)斜率作為蛋白質(zhì)表面的疏水性指數(shù)。

1.3.9 紫外光譜掃描

參照Liang Haini等[19]的方法并略作改動(dòng)。熱處理后的SPI樣品稀釋至0.2 mg/mL后進(jìn)行紫外光譜掃描，波長(zhǎng)范圍為250～310 nm，掃描速率為100 nm/min，分辨率為0.2 nm。

1.3.10 內(nèi)源色氨酸熒光光譜

參照Liu Yan等[20]的方法并略作改動(dòng)，熱處理后的SPI樣品用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋到0.2 mg/mL進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為300～460 nm，狹縫寬度均為2.5 nm，電壓為700 mV進(jìn)行熒光光譜掃描，所有測(cè)定重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每次實(shí)驗(yàn)做3 次平行，結(jié)果用 ±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件，組間差異顯著性采用t檢驗(yàn)分析（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)

實(shí)驗(yàn)所制得的SPI蛋白質(zhì)、水分、灰分和粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（87.22±0.44）%、（3.24±0.67）%、（3.39±0.53）%和（0.47±0.56）%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 熱處理對(duì)SPI柔性與結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 熱處理溫度對(duì)SPI柔性的影響

圖1 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)SPI柔性的影響Fig. 1 Flexibility of soy protein isolate under different heating treatment conditions

由圖1可知，處理溫度低于80 ℃，熱處理對(duì)SPI柔性影響不顯著，當(dāng)溫度高于80 ℃，SPI柔性隨著處理溫度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在121 ℃、30 min時(shí)達(dá)到最大。有文獻(xiàn)表明SPI中7S變性溫度在70 ℃以上，而11S的變性溫度大約在95 ℃左右[21]。處理溫度低于70 ℃，熱處理不足以破壞SPI的剛性結(jié)構(gòu)，所有熱處理對(duì)柔性影響不顯著，而高于80 ℃熱處理會(huì)破壞維系SPI剛性結(jié)構(gòu)的共價(jià)和/或非共價(jià)作用[21-22]（如范德華力、氫鍵、靜電相互作用、二硫鍵、疏水作用等）從而造成SPI柔性的增加。

2.2.2 熱處理溫度對(duì)SPI濁度的影響

圖2 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)SPI濁度的影響Fig. 2 Turbidity of soy protein isolate under different heating treatment conditions

由圖2可知，隨著處理溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI濁度逐漸增加，并在100 ℃處理?xiàng)l件下達(dá)到最大，熱處理溫度高于100 ℃，隨著SPI柔性持續(xù)增加，濁度卻發(fā)生了顯著下降。Cromwell等[23]認(rèn)為濁度與溶液中聚集體大小和數(shù)量有關(guān)，處理溫度在60～100 ℃，柔性的增強(qiáng)有利于SPI聚集體的形成而導(dǎo)致濁度的上升，處理溫度為121 ℃時(shí)柔性與濁度表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，可能是由于121 ℃高溫會(huì)使SPI形成較大的聚集體（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有沉淀產(chǎn)生）從而導(dǎo)致濁度的下降，但會(huì)持續(xù)破壞維系SPI剛性結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵（如二硫鍵，圖3）從而導(dǎo)致SPI柔性的增加。

2.2.3 熱處理溫度對(duì)SPI游離巰基含量的影響

圖3 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)SPI游離巰基含量的影響Fig. 3 Content of free sulfhydryl groups in soy protein isolate under different heating treatment conditions

由圖3可知，熱處理溫度高于60 ℃，SPI游離巰基含量隨柔性上升而上升，在121 ℃處理5 min時(shí)達(dá)到最大，隨后游離巰基含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。原因可能是當(dāng)SPI柔性上升到某一個(gè)值時(shí)，柔性的增加反而有利于斷裂生成的游離巰基在冷卻過(guò)程中發(fā)生重排，形成新的二硫鍵，從而導(dǎo)致游離巰基含量的下降。

2.2.4 熱處理溫度對(duì)SPI表面疏水性的影響

由圖4可知，SPI表面疏水性與濁度表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，隨著處理溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI表面疏水性隨柔性增加逐漸增大，在處理溫度為100 ℃時(shí)達(dá)到最大，隨后又下降?？赡艿慕忉尀樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)柔性的增加伴隨著原來(lái)隱藏在SPI內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在外從而導(dǎo)致表面疏水性的上升，而在121 ℃處理?xiàng)l件下形成的柔性更大的松散肽鏈在冷卻過(guò)程中易發(fā)生疏水相互作用引起蛋白質(zhì)的疏水聚集，導(dǎo)致SPI表面疏水性的降低。121 ℃處理?xiàng)l件下SPI表面疏水性的降低和游離巰基含量上升的結(jié)果與Wang Jinmei等[24]研究結(jié)果相似，他們認(rèn)為在這種情況下聚集體更易由疏水相互作用穩(wěn)定，部分游離巰基內(nèi)卷于聚集體內(nèi)部，抑制了分子間二硫鍵的形成，以維持蛋白的柔性構(gòu)象。

圖4 不同熱處理?xiàng)l件對(duì)SPI表面疏水性的影響Fig. 4 Surface hydrophobicity of soy protein isolate under different heating treatment conditions

2.2.5 熱處理SPI的紫外光譜分析

圖5 熱處理10 min SPI紫外吸收光譜Fig. 5 UV spectra of SPI with 10 min heating treatment

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收光譜主要是由于色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)紫外光的吸收作用，據(jù)蛋白質(zhì)對(duì)紫外光譜吸收的不同，可以推斷蛋白質(zhì)分子在溶液中構(gòu)象的變化[25]。由圖5可知，熱處理溫度在80～100 ℃范圍，SPI紫外吸收強(qiáng)度隨著柔性的增加而增加，表明隨柔性增加，SPI分子內(nèi)部發(fā)色基團(tuán)暴露在外部，SPI結(jié)構(gòu)變得更加舒展。而當(dāng)處理溫度上升到121 ℃過(guò)程中，紫外吸收強(qiáng)度隨柔性的繼續(xù)上升而下降（5、30 min處理?xiàng)l件結(jié)果相似），可能是因?yàn)榫奂w的形成（2.2.2節(jié)）導(dǎo)致暴露在外部的發(fā)色基團(tuán)重新隱藏在內(nèi)部從而導(dǎo)致紫外吸收強(qiáng)度的降低[25]。

2.2.6 熱處理SPI的內(nèi)源色氨酸熒光光譜分析

圖6 熱處理10 min SPI內(nèi)源色氨酸熒光光譜Fig. 6 Typical intrinsic emission fluorescence spectra of SPI with 10 min heating treatment

蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強(qiáng)度及發(fā)射波長(zhǎng)主要取決于暴露于溶液環(huán)境中的酪氨酸和色氨酸殘基的極性，或者兩者之間的相互作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，發(fā)色團(tuán)暴露于溶劑中會(huì)導(dǎo)致溶液熒光強(qiáng)度的降低[26-27]。由圖6可知，不同的熱處理?xiàng)l件，并沒(méi)有導(dǎo)致SPI在最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生偏移。然而，熱處理溫度在60～100 ℃范圍，所有經(jīng)過(guò)熱處理的SPI樣品的熒光強(qiáng)度都降低，原因可能是熱處理導(dǎo)致SPI的柔性增加，使得更多的發(fā)色團(tuán)暴露于溶劑中發(fā)生熒光猝滅從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，這與Liang Haini等[19]的研究結(jié)構(gòu)一致，他們認(rèn)為一定濃度尿素處理能降低牛血清白蛋白內(nèi)源性色氨酸熒光強(qiáng)度。而當(dāng)處理溫度繼續(xù)升到121 ℃時(shí)，熒光強(qiáng)度隨柔性的繼續(xù)上升又有了輕微上升（5、30 min處理?xiàng)l件結(jié)果相似），這與2.2.5節(jié)的結(jié)果一致，推測(cè)也可能是由于較大聚集體的形成導(dǎo)致。

2.3 SPI柔性與結(jié)構(gòu)關(guān)系分析

相關(guān)性分析指出，當(dāng)熱處理溫度范圍在60～100 ℃時(shí)，SPI柔性與濁度、游離巰基含量、表面疏水性呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)分別為0.956、0.954、0.954。SPI濁度、游離巰基含量與表面疏水性隨柔性上升而上升，其中濁度與柔性相關(guān)性最好，其次分別為游離巰基含量和表面疏水性。

為進(jìn)一步確定SPI柔性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，將處理溫度在60～100 ℃的柔性與濁度、游離巰基含量、表面疏水性分別進(jìn)行曲線(xiàn)擬合，結(jié)果如圖7所示。

圖7 SPI柔性與濁度（A）、游離巰基含量（B）、表面疏水性（C）擬合曲線(xiàn)Fig. 7 Fitting curves of turbidity (A), free sulfhydryl group content (B),and surface hydrophobicity (C) of SPI as a function of flexibility

處理溫度在60～100 ℃范圍，SPI柔性與濁度、游離巰基含量、表面疏水性的多項(xiàng)式擬合模型函數(shù)分別為y＝-1.937 57+10.640 22x-10.866 98x2、y＝-42.404 3+210.036 8x-198.824 56x2、y＝-1 674.016 59+8 421.410 56x-9 259.539 27x2，其中擬合度分別為0.911 24、0.902 59、0.915 15。濁度、游離巰基含量、表面疏水性在60～100 ℃范圍都能與柔性進(jìn)行較好的擬合，且擬合度都在0.900 00以上，表明SPI濁度、游離巰基含量和表面疏水性與柔性有較強(qiáng)的相關(guān)性。

3 結(jié) 論

熱處理溫度低于80 ℃時(shí)，對(duì)SPI柔性影響不顯著，熱處理溫度高于80 ℃時(shí)，SPI柔性隨處理溫度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

熱處理溫度在60～100 ℃范圍，SPI柔性與濁度、游離巰基含量、表面疏水性呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)分別為0.956、0.954、0.954。熱處理溫度在100～121 ℃范圍時(shí)，濁度、表面疏水性隨著柔性上升而下降，游離巰基含量隨著柔性的上升繼續(xù)上升，在121 ℃、5 min到達(dá)最大值，隨后又下降。

熱處理溫度在80～100 ℃范圍時(shí)，隨著SPI柔性的增加，其結(jié)構(gòu)更加舒展。

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