李少輝，賈俊強,2，桂仲爭,2,*

作為物理改性蛋白質(zhì)性質(zhì)的代表，磨球超微粉碎是一種簡便、常用的物理手段。它利用研磨體（如鋼球、石球、陶瓷球等）的沖擊作用以及研磨體與磨球內(nèi)壁的研磨作用將物料粉碎[1]，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而改善其功能特性[2]，常用于中藥粉碎[3]、小麥淀粉的處理[4]等。王丹丹[5]利用超微粉碎輔助化學(xué)改性處理豆渣，改性處理后豆渣持水力和膨脹率下降，陽離子交換能力增強。喬一騰等[6]利用超微粉碎技術(shù)對大豆分離蛋白進行改性處理，改性處理后的大豆分離蛋白的功能特性明顯提高。酶法改性是利用蛋白酶有限度地水解肽鍵或酰胺鍵，或者進行分子間共價交聯(lián)，使蛋白質(zhì)功能性質(zhì)發(fā)生定向改變[7]。由于酶法改性蛋白具有條件溫和及節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點，被廣泛用于蛋白質(zhì)的改性當中。黃群等[8]利用堿性蛋白酶改性卵白蛋白并優(yōu)化其工藝，在最優(yōu)條件下卵白蛋白起泡性可達202.0%，相比未處理組提高了1.683 倍。張兆麗[9]報道酶法改性可顯著提高花生分離蛋白的吸水性和乳化性。酶法改性還能應(yīng)用于大豆分離蛋白、大米蛋白、玉米胚芽蛋白等多種蛋白的改性中。然而，單一的物理改性、化學(xué)改性和酶法改性對蛋白質(zhì)特性的改變都有一定的局限性。因此，探討理化方法與酶解處理的聯(lián)合方法對改善蛋白質(zhì)的功能特性具有積極意義。

我國是世界上最大的蠶絲產(chǎn)地，蠶業(yè)歷史悠久[10]，年產(chǎn)鮮蠶蛹50萬 t以上。蠶蛹蛋白在干蠶蛹中的質(zhì)量分數(shù)達60%左右，含有18 種氨基酸，包含所有人體的必需氨基酸和含硫氨基酸，必需氨基酸在總氨基酸中的質(zhì)量分數(shù)約為42%，與非必需氨基酸含量的比值為0.7，高于世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）提出的參考蛋白模式值，是一種優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)蛋白源。經(jīng)特定微生物發(fā)酵工藝處理，蠶蛹蛋白的異味物質(zhì)可被有效脫除[11]。但繅絲過程中的高溫、堿煮等脫膠程序，易引起蠶蛹蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致其功能特性（如溶解性、起泡性、乳化性和持水性等）變差，限制了其在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[2]。目前，繅絲后的蠶蛹主要利用途徑有兩方面：一是經(jīng)簡單滅菌處理制成蠶蛹罐頭，作為初級食品食用；二是經(jīng)干燥粉碎后添加到動物飼料中，以提高家禽或家畜的生長性能?，F(xiàn)有加工技術(shù)僅處于簡單的初級加工水平，蠶蛹蛋白的高營養(yǎng)性和功能性未得到體現(xiàn)。為高效利用蠶蛹蛋白這一優(yōu)質(zhì)資源，其功能特性的改善已成為研究熱點。本實驗以蠶蛹蛋白為研究對象，結(jié)合磨球超微粉碎預(yù)處理和堿性蛋白酶解技術(shù)改性蠶蛹蛋白，研究其功能特性和相關(guān)免疫活性，為改性蠶蛹蛋白提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

繅絲后蠶蛹由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。

噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）美國Bio Basic有限公司；Alcalase 2.4L FG堿性蛋白酶 諾維信（中國）投資有限公司；石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、考馬斯亮藍G-250、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、葡聚糖凝膠G-100、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、甘氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、尿素、硫酸銅、5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、溴化鉀（均為分析純） 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H205DR-1高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；FDU-2100冷凍干燥機 日本東京理化器械；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；KS-JY92-IL超聲波細胞破碎機 寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；HZM系列振動磨球超微粉碎機 青島海納微粉工程有限公司；EL310型酶標儀 美國Bio-Tek公司；HERACELL 150i CO2培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；J-810型圓二色（circular dichroism，CD）光譜儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 蠶蛹蛋白的制備

將蠶蛹烘干、粉碎，然后用石油醚脫脂、烘干，備用。將脫脂蠶蛹粉用質(zhì)量分數(shù)為1%的NaOH溶液配制成質(zhì)量分數(shù)為10%的懸浮液，在55 ℃條件下恒溫水浴攪拌提取3 h后離心收集上清液，將所得的上清液用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，離心收集沉淀，冷凍干燥機冷凍干燥[12]。

1.3.2 微細化-蛋白酶解改性處理蠶蛹蛋白

將蠶蛹蛋白配制成質(zhì)量分數(shù)為8.3%的溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.1，用磨球超微粉碎機處理61 s。將處理后的溶液稀釋成質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0，用Alcalase 2.4L FG堿性蛋白酶進行酶解，加酶量為6 000 U/g，溫度為55 ℃，酶解2 h后煮沸使蛋白酶失活，冷卻后冷凍干燥，得到處理后蠶蛹蛋白粉，備用。

1.3.3 氨基酸分析

1.3.3.1 氨基酸組成分析

取0.5 g蛋白樣品溶于6 mL濃度為6 mol/L的HCl溶液中，置于水解管氮氣密封后，110 ℃條件下水解24 h。水解液采用鄰苯二甲醛柱前自動衍生，用反相高效液相色譜在338 nm波長處分析氨基酸組成。

1.3.3.2 營養(yǎng)學(xué)評價

根據(jù)FAO/WHO建議的氨基酸評分標準模式和中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所提出的雞蛋蛋白質(zhì)模式進行營養(yǎng)評價。按公式（1）～（3）分別計算氨基酸評分（amino acid score，AAS）、化學(xué)評分（chemical score，CS）及必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）[13-14]。

式中：n為比較的氨基酸數(shù)目；t為實驗蛋白質(zhì)的氨基酸含量/（mg/g）；s為雞蛋蛋白質(zhì)的氨基酸含量/（mg/g）。

1.3.4 水解度的測定

水解度的測定采用pH-stat法[15]，水解度用公式（4）計算。

式中：c（NaOH）是所用NaOH溶液的濃度/（mol/L）；V（NaOH）是消耗NaOH溶液的體積/mL；α是α-NH2的解離度；mp是底物蛋白的質(zhì)量/g；htot是底物蛋白的肽鍵含量/（mmol/g）。對于蠶蛹蛋白，htot為8.2 mmol/g，α為0.44。

1.3.5 巰基與二硫鍵含量測定

巰基含量測定采用Beveridge等[16]的方法，略作修改。分別取0.5 g經(jīng)不同處理的蛋白樣品，溶解于50 mL的pH值為8.0的Tris-Gly緩沖液中，稀釋一定倍數(shù)，測定其質(zhì)量濃度。取蛋白樣品0.5 mL，加入2.5 mL尿素濃度為8 mol/L的Tris-Gly緩沖液（pH 8.0），再加入0.02 mL質(zhì)量濃度為4 g/L的DTNB，迅速混勻后在25 ℃下反應(yīng)30 min，用紫外-可見分光光度計測定其在412 nm波長處的吸光度。巰基含量cSH/（μmol/g）的計算見式（5）。

式中：ASH為巰基吸光度；ρS為樣品蛋白質(zhì)量濃度/（g/L）。

分別取經(jīng)不同處理的蛋白樣品溶液0.5 mL，加入5 mL尿素濃度為10 mol/L的Tris-Gly緩沖液（pH 8.0），再加入0.1 mL β-巰基乙醇，在25 ℃下反應(yīng)1 h，加入50 mL質(zhì)量分數(shù)為12%的三氯乙酸溶液，繼續(xù)反應(yīng)1 h后，離心去上清液，沉淀用50 mL質(zhì)量分數(shù)為12%的三氯乙酸溶液洗滌，離心去上清液，重復(fù)操作2 次，最后在沉淀中加入15 mL尿素濃度為8 mol/L的Tris-Gly緩沖液（pH 8.0），然后加入0.15 mL質(zhì)量濃度為4 g/L的DTNB，迅速混勻后在25 ℃下反應(yīng)30 min，用紫外-可見分光光度計測定其在412 nm波長處的吸光度。二硫鍵含量cSS/（μmol/g）的計算公式為：

式中：ASS為二硫鍵吸光度；ρS為樣品蛋白的質(zhì)量濃度/（g/L）；cSH為巰基含量/（μmol/g）。

1.3.6 CD光譜的測定

將樣品蛋白配制成1 μg/mL，利用CD光譜儀進行測定，掃描波長范圍為190～250 nm，樣品池的光徑為0.1 cm，掃描速率100 nm/min，并用Bio-Logic快速動力學(xué)光譜分析系統(tǒng)進行分析。

1.3.7 分子質(zhì)量分布的測定

將樣品用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液配制成10 g/L的溶液。樣品溶液過葡聚糖凝膠G-100凝膠柱分離，用恒流泵控制磷酸鹽緩沖液的洗脫速率為1 mL/min，每2 min收集一個樣品，用紫外分光光度計測定其在280 nm波長處的吸光度。

1.3.8 溶解度的測定

分別取0.1 mL的樣品溶液和0.9 mL蒸餾水混合，然后加5.0 mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合，靜置2 min后，在595 nm波長處測定吸光度，根據(jù)得到的標準曲線計算得到的蛋白質(zhì)量濃度。取蠶蛹蛋白樣品2 g懸浮于100 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為7.0，攪拌30 min后8 000 r/min離心20 min，測上清液中的蛋白質(zhì)量濃度[17]。

1.3.9 乳化性的測定

在測試管中分別加入15 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的蛋白質(zhì)溶液和5 mL玉米油，用高速均質(zhì)機24 000 r/min處理1 min后，從測試管底部取出50 μL乳化液，用1 g/L十二烷基硫酸鈉稀釋100 倍后，于500 nm波長處比色，測定吸光度A0。同樣地，在10 min后，取樣測定吸光度A10。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）/（m2/g）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）的計算公式如式（7）、（8）[18]。

式中：ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（g/L）；φ為光程/（0.01 m）；θ為油相所占的比例。

1.3.10 起泡性的測定

取50 mL 1 g/L的蛋白溶液置于25 ℃水浴中，使用高速分散器以13 500 r/min分散2 次，每次30 s，快速移至250 mL量筒，記下泡沫體積V0。以起泡度作為蛋白溶液起泡能力（foaming capacity，F(xiàn)C）的評價參數(shù)，并按式（9）計算。

將量筒靜置30 min后，再測量泡沫的殘留體積Vr。泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S）按式（10）進行計算[19]。

1.3.11 促小鼠脾細胞增殖實驗

取8 周齡小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，用注射器塞研磨后，于200 目銅網(wǎng)過篩，收集細胞懸液，離心去上清液，加紅細胞裂解液裂解，然后加入培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)，并將脾細胞濃度調(diào)整至5×106個/mL。

在96 孔板中加入5×106個/mL的脾細胞懸液，100 μL/孔。再分別加入蠶蛹蛋白樣品溶液100 μL，每個樣品設(shè)3 個劑量（25、50、100 μg/mL），每個劑量設(shè)3 個重復(fù)。對照組加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出后1 000 r/min離心5 min，吸去上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，輕輕振蕩使紫色結(jié)晶溶解，置暗處室溫反應(yīng)15 min后用酶標儀于570 nm波長處測OD值[20]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗中樣品處理重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS18.0軟件進行分析，結(jié)果以 ±s表示，用Tukey test法進行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微細化-蛋白酶解對蠶蛹蛋白營養(yǎng)價值的影響

2.1.1 氨基酸組成分析

表1 不同處理蠶蛹蛋白的氨基酸組成比較Table 1 Comparison of amino acid composition of silkworm pupa protein after different treatments

由于色氨酸在酸水解條件下被破壞，共檢測出17 種氨基酸。未處理的對照組蠶蛹蛋白必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為54.66%，低于理想蛋白模式標準（60%）；經(jīng)微細化、蛋白酶解和微細化-酶解處理后，其必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值分別為64.21%、65.09%和66.79%，均高于理想蛋白模式標準。處理前蠶蛹蛋白的必需氨基酸/總氨基酸的值為35.34%，略低于FAO/WHO模式36%的標準；不同處理后蠶蛹蛋白的必需氨基酸/總氨基酸的值分別為39.10%、39.43%和40.05%，均高于FAO/WHO推薦模式標準。陳佳婕等[21]報道酶解處理顯著提高了蠶蛹蛋白必需氨基酸含量，其中雙酶解處理后其必需氨基酸/總氨基酸的值達到45%。

2.1.2 氨基酸營養(yǎng)評價

不同處理后蠶蛹蛋白的AAS值除蘇氨酸外均高于100，對照組蘇氨酸的AAS值為46.5，微細化、蛋白酶解和微細化-酶解處理后蘇氨酸的AAS值分別為85.54、83.97和70.71。蘇氨酸是一種重要的營養(yǎng)強化劑，具有緩解人體疲勞、促進生長發(fā)育的效果。其他氨基酸的AAS值與未處理組相比也得到了不同程度的提高，說明改性處理后的蠶蛹蛋白的營養(yǎng)價值得到提升，高于FAO/WHO推薦模式標準以及雞蛋的營養(yǎng)價值。

經(jīng)3 種方法改性處理后的蠶蛹蛋白EAAI值分別為94.67、96.13和93.86，均高于對照組的92.34，略低于經(jīng)雙酶解改性處理的蠶蛹蛋白多肽產(chǎn)物[21]。

表2 不同處理蠶蛹蛋白的氨基酸營養(yǎng)評價Table 2 Nutritional assessment of silkworm pupa protein after different treatments

2.2 微細化-蛋白酶解改性處理對蠶蛹蛋白物理特性的影響

2.2.1 對蠶蛹蛋白水解度的影響

圖1 微細化-蛋白酶解后蠶蛹蛋白水解度變化Fig. 1 Changes in the hydrolysis degree of silkworm pupa protein treated by micronization-alcalase

圖1顯示蠶蛹蛋白在微細化預(yù)處理后，經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶酶解不同時間（30、60、90、120、150、180 min）水解度的變化。酶解前期，蠶蛹蛋白的水解度隨酶解時間的延長顯著增加，經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶酶解90 min，細微化處理水解度較未處理提高了65.62%；再延長酶解時間對水解度幾乎沒有影響。酶解時間與蛋白水解度的關(guān)系與趙鵬等[22]報道的結(jié)果一致。金建等[23]的研究表明，經(jīng)超聲波預(yù)處理后堿性蛋白酶酶解可顯著提高玉米蛋白的水解度。這可能是因為機械預(yù)處理后蠶蛹蛋白的溶解性提高，使底物與酶更好地接觸，反應(yīng)速率增加；另一方面，處理后蛋白分子質(zhì)量變小，可能暴露出更多的酶的結(jié)合位點，促進了反應(yīng)的進行。

2.2.2 對溶解度、起泡性和乳化性的影響

表3結(jié)果顯示，經(jīng)過3 種改性方法可顯著提高蠶蛹蛋白的溶解度、起泡性和乳化性，其中微細化-酶解改性處理可分別提高了169.41%、97.82%和21.52%。微細化-酶解復(fù)合處理后蠶蛹蛋白的起泡穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性比單一處理略低，這可能是由于復(fù)合處理后，蛋白質(zhì)分子變得更小，而溶解性的提高不利于形成泡沫和乳化狀態(tài)。任子旭等[24]用超聲波改性處理蠶蛹蛋白得到最優(yōu)工藝，在此條件下，改性蠶蛹蛋白的溶解度、乳化性和起泡性分別是處理前的4.02、1.87 倍和1.41 倍。金青哲等[25]研究表明經(jīng)酶解改性處理后蠶蛹蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)特別是溶解性大為改善；鐘振聲等[26]利用物理方法處理大豆分離蛋白，能夠很好地改善其起泡性和乳化性。說明這些蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)可通過物理、化學(xué)、酶解等手段獲得改善。

2.3 微細化-蛋白酶解改性處理對蠶蛹蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 對蠶蛹蛋白分子質(zhì)量的影響

以葡聚糖凝膠柱分離蠶蛹蛋白，測定280 nm波長處吸光度，獲得圖2分子質(zhì)量分布曲線。由結(jié)果可以看出不同處理的蛋白均有2 個洗脫峰，分別在15 min和54 min。在15 min時，未處理、微細化、酶解及微細化-酶解處理蛋白的洗脫峰依次降低，而在54 min時的洗脫峰依次升高，說明經(jīng)微細化、酶解及微細化-酶解處理后，大分子質(zhì)量的蛋白減少，小分子質(zhì)量的蛋白增多。未處理的對照蛋白在18～42 min間有多個小峰，在54 min處有2 個并肩峰，說明其分子質(zhì)量不均一，分子質(zhì)量小的物質(zhì)較少且不均勻。改性處理后蛋白在54 min的洗脫峰逐漸變窄，說明蛋白的分子質(zhì)量更加集中。

圖2 不同處理蠶蛹蛋白的分子質(zhì)量分布Fig. 2 Molecular weight distribution of silkworm pupa protein after different treatments

2.3.2 對蠶蛹蛋白巰基和二硫鍵含量的影響

二硫鍵與穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和性能的關(guān)系非常密切，尤其是會影響到蛋白質(zhì)表面活性的表現(xiàn)[27]。不同處理蠶蛹蛋白的巰基與二硫鍵的含量見圖3。結(jié)果顯示，處理后蠶蛹蛋白的巰基含量明顯升高，二硫鍵含量降低，經(jīng)微細化-酶解改性處理后蠶蛹蛋白巰基含量增加了57%，二硫鍵含量降低了21%。韓苗等[28]利用超聲波處理蠶蛹蛋白發(fā)現(xiàn)二硫鍵含量降低，巰基含量增加，本研究的結(jié)果與之相似，這可能是由于在處理時導(dǎo)致二硫鍵斷裂，暴露出更多的巰基。

圖3 不同改性處理后蠶蛹蛋白的二硫鍵與巰基含量變化Fig. 3 Changes in the contents of sulfhydryl group and disulfide bond in silkworm pupa protein after different treatments

2.3.3 對蠶蛹蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的CD光譜一般分為2 個波長范圍，即遠紫外區(qū)（178～250 nm）和近紫外區(qū)（250～320 nm）。蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)可通過遠紫外區(qū)CD光譜數(shù)據(jù)反映出來，一般天然蛋白質(zhì)的CD光譜含有一個正峰（190 nm波長處）和一個負槽（205～235 nm波長范圍）[29]。利用軟件分析得到不同改性處理后蠶蛹蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的含量（表4）。未處理蠶蛹蛋白的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的含量分別為20.00%、23.61%、18.83%和37.46%，結(jié)果與賈俊強等[30]的研究極為接近，即蠶蛹水溶性蛋白的α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角以及無規(guī)卷曲的含量分別為20.9%、24.1%、19.2%和36.4%。微細化-酶解改性處理后蠶蛹蛋白的無規(guī)卷曲含量超過90%，說明其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生極大的變化，α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)幾乎被完全破壞，可能暴露出更多的功能位點或活性位點。

表4 不同改性處理蠶蛹蛋白二級結(jié)構(gòu)的比較Table 4 Comparison of the secondary structure of silkworm pupa protein after different treatments%

2.4 微細化-蛋白酶解改性處理后的蠶蛹蛋白對小鼠脾細胞增殖的影響

為了解改性蛋白的免疫調(diào)節(jié)能力，本實驗研究了微細化-蛋白酶解改性處理后蠶蛹蛋白對小鼠脾細胞增殖的影響（表5）。不同改性蠶蛹蛋白均具有促進小鼠脾細胞增殖的能力，隨著劑量的增加其增殖能力升高；同等劑量條件下，促進小鼠脾細胞增殖能力由高到低依次是微細化-蛋白酶解、酶解、微細化和未處理。經(jīng)微細化-蛋白酶解改性處理，25 μg/mL的蠶蛹蛋白促進小鼠脾細胞增殖能力較對照組提高了100%，在50 μg/mL時提高79.56%，在100 μg/mL時提高52.61%。昌友權(quán)等[31]報道蠶蛹蛋白能夠明顯促進B淋巴細胞和T淋巴細胞的增殖，蠶蛹蛋白具有較強的提高免疫活性的能力，經(jīng)微細化-蛋白酶解改性處理后其提高免疫活性能力可進一步增強。

表5 不同改性蠶蛹蛋白對小鼠脾細胞增殖能力的影響Table 5 Effect of silkworm pupa protein subjected to different treatments on the proliferation of mouse splenocytes

3 結(jié) 論

與未處理的蠶蛹蛋白相比，微細化-酶解改性處理后蠶蛹蛋白的水解度提高了65.62%，溶解度、乳化性和起泡性分別提高了402%、187%和141%，巰基含量增加了57%，而二硫鍵含量降低了21%，且分子大小和二級結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了較明顯的變化，小分子物質(zhì)增多，無規(guī)卷曲含量由37.46%增加到91.33%。微細化-酶解改性處理后蠶蛹蛋白必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值達到了理想蛋白模式標準（60%），必需氨基酸/總氨基酸的值也達到了FAO/WHO推薦模式標準（36%），蛋白營養(yǎng)價值得到顯著提高。微細化-酶解改性處理后的蠶蛹蛋白在劑量為25 μg/mL時，促小鼠脾細胞增殖能力增加了100%，免疫調(diào)節(jié)能力顯著提高。

參考文獻：

[1] 林江嬌, 朱立學(xué), 韋鴻鈺. 銀杏干葉球磨法超微粉碎的試驗研究[J].仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報, 2011, 24(4): 62-64. DOI:10.3969/j.issn.1674-5663.2011.04.018.

[2] 周志峰, 任子旭, 賈俊強, 等. 磨球超微粉碎改性蠶蛹蛋白的工藝優(yōu)化及功能特性[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 36(6): 679-684.DOI:10.3969/j.issn.1671-7775.2015.06.011.

[3] 李壯哲, 盧偉文, 黃志洪, 等. 藥用三七球磨法超微粉碎的試驗研究[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報, 2014, 27(3): 18-22. DOI:10.3969/j.issn.1674-5663.2014.03.005.

[4] 沈莎莎, 田建珍, 鄭學(xué)玲, 等. 球磨微細化處理對硬質(zhì)小麥淀粉理化特性影響研究[J]. 糧食與油脂, 2014, 27(4): 19-22. DOI:10.3969/j.issn.1008-9578.2014.04.005.

[5] 王丹丹. 豆渣超高壓、超微粉碎及超聲波輔助化學(xué)處理的研究[D].鄭州: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013: 15-18.

[6] 喬一騰, 司玉慧, 蓋國勝, 等. 超微粉碎對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 中國食品學(xué)報, 2012, 12(9): 57-61.

[7] 程云龍, 管軍軍, 李世豪, 等. 酶法改性大豆分離蛋白最新研究進展[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2015(3): 20-23; 27. DOI:10.7633/j.issn.1003-6202.2015.03.006.

[8] 黃群, 楊萬根, 金永國, 等. 酶法改善卵白蛋白起泡性[J]. 食品科學(xué),2014, 35(23): 171-175. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201423034.

[9] 張兆麗. 酶法改性花生分離蛋白的研究[J]. 濰坊工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報,2015, 28(2): 84-86. DOI:10.3969/j.issn.1009-2080.2015.02.022.

[10] 張海娜. 蠶蛹活性多肽的制備及降血壓、降血糖活性研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2013: 1-2.

[11] 賈俊強, 桂仲爭, 吳瓊英, 等. 同時蒸餾萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析蠶蛹揮發(fā)性成分[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2011, 37(6): 1111-1116.DOI:10.3969/j.issn.0257-4799.2011.06.025.

[12] 李朝品, 湛孝東, 施自倫. 蠶蛹蛋白提取研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2011(2): 26-27; 35. DOI:10.3969/jissn.1671-9646(X).2011.02.007.

[13] WU Q Y, JIA J Q, TAN G X, et al. Physicochemical properties of silkworm larvae protein isolate and gastrointestinal hydrolysate bioactivities[J]. African Journal of Biotechnology, 2011, 10(32): 6145-6153. DOI:10.12737/13127.

[14] 吳瓊英, 徐金玲, 賈俊強, 等. 蠶蛹不同溶解性蛋白的營養(yǎng)學(xué)評價及酶解物對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的抑制活性[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2011, 37(2):352-357. DOI:10.3969/j.issn.0257-4799.2011.02.028.

[15] LI Z J, YIN X M, YE J. Effects of pH management during deep hypothermic bypass on cerebral oxygenation: alpha-stat versus pH-stat[J]. Journal of Zhejiang University (Science), 2004, 5(10):1290-1297. DOI:10.1631/jzus.2004.1290.

[16] BEVERIDGE T, TOMA S J, NAKAI S. Determination of SH- and SS-groups in some food proteins using Ellman’s reagent[J]. Journal of Food Science, 2006, 39(1): 49-51. DOI:10.1111/j.1365-2621.1974.tb00984.x.

[17] YIN S W, TANG C H, CAO J S, et al. Effects of limited enzymatic hydrolysis with trypsin on the functional properties of hemp (Cannabis sativa L.) protein isolate[J]. Food Chemistry, 2008, 106(3): 1004-1013.DOI:10.1016/j.foodchem.2007.07.030.

[18] 張根生, 岳曉霞, 李繼光, 等. 大豆分離蛋白乳化性影響因素的研究[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(7): 48-51. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.07.005.

[19] 劉堅, 江波, 李艷紅, 等. 超高壓對鷹嘴豆分離蛋白起泡性能的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(28): 9012-9013. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2007.28.114.

[20] 劉洋, 殷璐, 龔桂萍, 等. 黑果枸杞葉多糖LRLP3的結(jié)構(gòu)、抗氧化活性及免疫活性[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2016, 37(2): 261-268.DOI:10.7503/ cjcu20150690. doi:10.7503/cjcu20150690.

[21] 陳佳婕, 吳文惠, 倪玲, 等. 蠶蛹蛋白的氨基酸構(gòu)成分析及模擬胃/腸道消化性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(1): 333-338.

[22] 趙鵬, 董秀萍, 葉楠, 等. 酶解蠶蛹蛋白工藝的研究及產(chǎn)物分析[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報, 2005, 24(2): 123-127. DOI:10.3969/j.issn.1674-1404.2005.02.012.

[23] 金建, 馬海樂, 曲文娟, 等. 超聲預(yù)處理對玉米蛋白可酶解性的影響[J]. 中國糧油學(xué)報, 2015, 30(11): 58-64. DOI:10.3969/j.issn.1003-0174.2015.11.011.

[24] 任子旭, 周志峰, 方銀, 等. 用超聲波改善蠶蛹蛋白性能的工藝條件優(yōu)化及產(chǎn)品性能測試[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2015, 41(3): 548-554.

[25] 金青哲, 劉元法, 王興國. 蠶蛹蛋白酶法改性研究[J]. 食品科技,2004(2): 35-39. DOI:10.3969/j.issn.1005-9989.2004.02.012.

[26] 鐘振聲, 文錫蓮, 陳然, 等. 物理改性對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 中國油脂, 2008, 33(5): 21-24. DOI:10.3321/j.issn:1003-7969.2008.05.007.

[27] 李麗娜, 李軍生, 閻柳娟, 等. 分光光度法測定食品蛋白質(zhì)中二硫鍵的含量[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(8): 562-564. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.08.135.

[28] 韓苗, 顏縱橫, 賈俊強, 等. 超聲波處理對蠶蛹蛋白理化性質(zhì)及酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2016, 42(4): 711-716.DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2016.04.021.

[29] 沈瓊, 黃濱, 邵嘉亮, 等. 運用圓二色譜研究酶與化合物相互作用的機理[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2006, 45(4): 62-64.DOI:10.3321/j.issn:0529-6579.2006.04.015.

[30] 賈俊強, 徐金玲, 譚廣秀, 等. 蠶蛹水溶性蛋白營養(yǎng)學(xué)評價及理化性質(zhì)分析[J]. 食品研究與開發(fā), 2011, 32(8): 121-125. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2011.08.038.

[31] 昌友權(quán), 戚穎欣, 孫學(xué)偉, 等. 蠶蛹蛋白對小鼠免疫作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(9): 520-523. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2007.09.127.