鄒 曼，張玉環(huán)，陳義倫,*，馬新鳳，王桂欣，馬 超，朱風(fēng)濤

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東 泰安 271000；2.中華全國供銷總社濟(jì)南果品研究院，山東 濟(jì)南 250014）

新疆阿克蘇灰棗（Zizyphus jujube cv. Huizao）是阿克蘇地區(qū)的主栽品種，引種于河南新鄭，因得天獨厚的光熱資源，成為新疆紅棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主導(dǎo)品種。阿克蘇灰棗富含多種微量元素和多糖、黃酮、三萜類、多酚類、環(huán)核苷酸、生物堿、胡蘿卜素、VC等功能成分[1]，多糖、黃酮、酚酸、萜類化合物和環(huán)核苷酸是棗果中主要功能性成分。多糖是棗果發(fā)揮護(hù)肝和免疫刺激作用的物質(zhì)基礎(chǔ)；VC、酚酸和黃酮類化合物是棗果中主要的抗氧化物質(zhì)；三萜類化合物是棗果中主要的抗癌活性成分[2]。大棗具有免疫[3]、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎、護(hù)肝、護(hù)腸、抗焦慮、防止肥胖、抑菌等特性[2,4]。

多糖是大棗中重要的生物活性物質(zhì)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)良好的調(diào)節(jié)劑，主要表現(xiàn)為免疫增強(qiáng)或免疫刺激，它不僅能激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，還能提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力[5-6]；以熊果酸和齊墩果酸為代表的五環(huán)三萜類化合物是棗果實的主要活性成分[7]，具有提高免疫力、殺傷癌細(xì)胞和抗腫瘤等多種功能[8-9]；棗多酚提取物具有明顯的提高機(jī)體自身免疫能力和抗逆境功效[10]。目前我國棗果實功能成分及其保健食品的研究與開發(fā)尚處于起步階段，免疫作用是紅棗的重要保健作用之一，不同棗品種的免疫功能成分需深入研究闡明，棗果實中的多糖、多酚和三萜類化合物都具有免疫調(diào)節(jié)活性，但其交互作用需進(jìn)一步深入研究明確。

通過小鼠免疫臟器指數(shù)、碳粒廓清實驗、血清溶血素形成實驗和綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)實驗，研究新疆阿克蘇灰棗多糖、多酚和三萜類化合物3 種活性成分及其兩兩組合對小鼠免疫功能的影響，以期闡明新疆阿克蘇灰棗的免疫活性因子及其相互間的作用，為新疆灰棗免疫功能特性研究與功能產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購于山東泰邦生物制品有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2013 0006。

新疆阿克蘇灰棗由中華全國供銷總社濟(jì)南果品研究院提供。

印度墨汁 北京Solarbio公司；綿羊紅細(xì)胞懸液、補(bǔ)體（豚鼠血清） 鄭州百基生物科技有限公司；生理鹽水 山東華信制藥集團(tuán)股份有限公司；乙醇、氯仿、正丁醇均為分析純。

都氏試劑：碳酸氫鈉1.0 g、氰化鉀0.05 g、高鐵氰化鉀0.2 g，加蒸餾水至1 000 mL，置4 ℃冰箱保存。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華有限公司；EQUINOX55型傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FA2104A分析天平 上海精天電子儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 鄭州長城有限公司；NE-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；T-6新世紀(jì)紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BSZ-100自動部分收集器、HL-2恒流泵 上海滬西儀器廠有限公司；Alphal-2凍干機(jī) 德國Christ公司；TDL-40B高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；游標(biāo)卡尺（精確度0.02mm） 無錫凱保鼎工具有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

棗粉的制備：灰棗經(jīng)清洗、去核，50 ℃烘干后，粉碎并過40 目篩。

灰棗多糖提?。喝?0 g棗粉，加300 mL蒸餾水，70℃水浴6h，抽濾，濾液加4倍無水乙醇醇沉12h，離心棄上清液，蒸餾水溶解多糖沉淀，Sevag法脫蛋白6次，透析，凍干[11]。取樣品經(jīng)KBr壓片，4000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)經(jīng)紅外光譜掃描[12]，光譜圖在3 400 cm-1和2 940 cm-1有糖類物質(zhì)的特征吸收峰[13]，經(jīng)鑒定為多糖且純度為93.87%，經(jīng)換算得棗中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.61%。

灰棗多酚提取：取10 g棗粉，加250mL 80%乙醇，超聲提取25min，抽濾，濾液濃縮，過AB-8大孔吸附樹脂，收集洗脫液，濃縮至無醇味，透析，凍干[14]。以茴香醛- 濃硫酸-乙醇體系為顯色劑，甲醇-水和氯仿-甲醇-甲酸為展開體系，經(jīng)薄層層析分析確定樣品為多酚[15]。經(jīng)福林-酚比色法確定多酚純度為41.32%，經(jīng)換算得棗中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.824%。

灰棗三萜類化合物提取：取10 g棗粉，加250 mL 80%乙醇，超聲提取20 min[16]，抽濾，濾液濃縮，過S-8大孔吸附樹脂，收集洗脫液，濃縮至無醇味，透析，凍干[17]。經(jīng)Molish反應(yīng)和Liebermann-Burchard反應(yīng)為陽性，確定樣品為三萜類化合物[18]，經(jīng)香草醛冰醋酸比色法確定純度為63.17%，經(jīng)換算得棗中三萜類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.865%。

1.3.2 實驗動物分組及給藥方法

設(shè)計空白對照、多糖、多酚、三萜、多糖+多酚、多糖+三萜、多酚+三萜7 個實驗組，每組10 只小鼠，以100 mg/kg的劑量每天經(jīng)口灌胃，空白對照組灌以等量蒸餾水，連續(xù)給予受試物7 d后活殺小鼠并測定各項免疫指標(biāo)[19]。

1.3.3 對小鼠免疫器官的影響

連續(xù)給予受試物7 d后稱小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死小鼠，取脾臟、胸腺用濾紙吸干血跡后稱其濕質(zhì)量，分別根據(jù)式（1）、（2）計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)[6]。

1.3.4 對小鼠碳粒廓清速率的影響

末次給藥后1 h，稱體質(zhì)量，各鼠均按0.1 mL/10 g劑量由尾靜脈注入印度墨汁（以生理鹽水按體積比1∶5稀釋），注射后分別在1 min（t1）、10 min（t2）從小鼠眼眶靜脈叢取血20 μL溶于2.0 mL 0.1% Na2CO3溶液中搖勻，放置20 min后于680 nm波長處測其吸光度，以0.1% Na2CO3溶液為空白對照，將小鼠處死后取肝臟和脾臟，稱質(zhì)量，分別根據(jù)式（3）、（4）計算廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)α值[20]。

式中：t1、t2分別為取血時間；A1、A2分別為在時間t1、t2時所取血樣對應(yīng)的吸光度。

1.3.5 對小鼠血清溶血素的影響

給藥第3天，每鼠腹腔注射2% SRBC 0.2 mL致敏，并繼續(xù)給藥。致敏后第4天于末次給藥后90 min取小鼠眼球血，靜置1h，2 000 r/min離心10 min，取上層血清20 μL用生理鹽水稀釋50倍，取此血清樣1 mL加10% SRBC混懸液0.5 mL，置冰浴，再加入以生理鹽水1∶10稀釋的豚鼠血清1 mL混合，另設(shè)不加血清的空白對照，37 ℃溫浴30min，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)管立即移入冰浴中，以終止反應(yīng)，以2 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加3 mL都氏試劑，混勻，放置10 min后于540 nm波長處測其吸光度，另取10% SRBC混懸液0.25 mL加都氏試劑至4 mL，同上測定吸光度，作為半數(shù)溶血值（half value of hemolysis，HC50）[20]。

血清溶血素含量以HC50表示，HC50根據(jù)式（5）計算。

式中：A1、A2分別為樣品的吸光度和SRBC半數(shù)溶血時的吸光度。

1.3.6 對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

給藥第3天，每鼠腹腔注射2% SRBC 0.2 mL致敏，并繼續(xù)給藥。致敏后第4天取20% SRBC 50 μL懸液注射在小鼠右側(cè)足墊皮下，24 h后用游標(biāo)卡尺測定小鼠右足墊厚度，同一部位測量3 次，取平均值[20]。

1.3.7 多糖、多酚和三萜類化合物兩兩組合免疫交互作用的評價方法

當(dāng)受試物的組合產(chǎn)生的效果顯著大于其單獨使用效果之和時，判定該組合產(chǎn)生了協(xié)同作用；當(dāng)受試物的組合產(chǎn)生的效果與其單獨使用效果之和差異不顯著時，判定該組合產(chǎn)生了加和作用；當(dāng)受試物的組合產(chǎn)生的效果顯著小于其單獨使用效果之和時，判定該組合產(chǎn)生了拮抗作用[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

實驗所得數(shù)據(jù)利用SPSS Stastistics 20軟件進(jìn)行分析處理。各組間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰棗活性成分及組合對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

小鼠每天經(jīng)口灌胃給予100 mg/kg劑量的受試物，連續(xù)給藥7 d后，稱質(zhì)量，取脾臟、胸腺并稱其濕質(zhì)量，計算免疫器官指數(shù)。由圖1可知，灰棗3 種不同成分及其兩兩組合的灌胃處理，均可增加實驗小鼠的免疫器官質(zhì)量，提高小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，其影響排序為：多糖+多酚＞多糖+三萜＞多酚+三萜＞多糖＞多酚＞三萜。經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析表明，單一成分組即多糖組、多酚組和三萜組的脾臟指數(shù)分別為3.48、3.25、3.18 mg/g，胸腺指數(shù)分別為2.15、2.06、1.95 mg/g，與空白對照組的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)（2.88、1.76 mg/g）差異顯著（P＜0.05）；多糖+多酚組的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)為7.06、4.52 mg/g，較空白對照組差異達(dá)到高度顯著水平（P＜0.001），多糖+三萜組和多酚+三萜組的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)分別為6.62、6.44 mg/g和4.07、4.06 mg/g，與空白對照之間也達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。說明多糖和多糖+多酚組合更可促使小鼠的胸腺和脾臟質(zhì)量增加，促進(jìn)其產(chǎn)生免疫細(xì)胞[22-23]。

圖1 灰棗3 種活性成分及組合對小鼠免疫器官的影響Fig. 1 Effect of three bioactive components of Huizao jujubes on mouse immune organs

2.2 灰棗3 種活性成分及組合對小鼠碳粒廓清速率的影響

圖2 灰棗3 種活性成分及組合對小鼠碳粒廓清速率的影響Fig. 2 Effect of three bioactive components of Huizao jujubes on phagocytic index

由圖2可知，灰棗3 種不同成分及其兩兩組合的灌胃處理均可提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)α。經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析表明，多糖組、多酚組和三萜組的吞噬指數(shù)α分別為3.67、3.53和3.48，與空白對照組的吞噬指數(shù)α（3.04）差異顯著（P＜0.05）；多糖+多酚組的吞噬指數(shù)α為7.40，較空白對照組差異達(dá)到高度顯著水平（P＜0.001）；多糖+三萜組和多酚+三萜組的吞噬指數(shù)α分別為7.02和6.91，較空白對照組差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。由此表明灰棗多糖、多酚和三萜類化合物及其組合均具有提高小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬能力、增強(qiáng)非特異性免疫的作用。說明灰棗多糖、多酚及其組合更能顯著增強(qiáng)小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，加速碳粒的清除[24]。

2.3 灰棗3 種活性成分及組合對小鼠血清溶血素的影響

圖3 灰棗3 種活性成分及其組合對小鼠血清溶血素的影響Fig. 3 Effect of three bioactive components of Huizao jujubes on HC50

由圖3可知，灰棗3 種不同成分及其兩兩組合的灌胃處理，均可提高小鼠的HC50，也就是可以增加小鼠的血清溶血素含量。經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析表明，單一成分組即多糖組、多酚組和三萜組的HC50分別為0.59、0.56和0.52，較空白對照組的HC50均差異顯著（P＜0.05）；多糖+多酚組的HC50為1.27，與空白對照組差異達(dá)到高度顯著水平（P＜0.001），多糖+三萜組和多酚+三萜組的HC50分別為1.15和1.10，與空白對照組之間也達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。由此表明灰棗多糖、多酚和三萜類化合物及其組合均具有提高小鼠血清溶血素含量、增強(qiáng)小鼠體液免疫的作用。說明多糖和多糖與多酚組合更可促進(jìn)小鼠溶血素抗體的形成[25]。

2.4 灰棗3 種活性成分及其組合對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)又稱“遲發(fā)型超敏反應(yīng)”，屬細(xì)胞免疫，是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的一種超敏反應(yīng)。由圖4可知，灰棗3 種不同成分及其兩兩組合的灌胃處理，均可增加小鼠的足跖厚度。經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析表明，單一成分組即多糖組、多酚組和三萜組小鼠足跖厚度分別為1.96、1.90mm和1.86mm，與空白對照組的小鼠足跖厚度差異顯著（P＜0.05）；多糖+多酚組的足跖厚度為3.99mm，較空白對照組差異達(dá)到高度顯著水平（P＜0.001），多糖+三萜組和多酚+三萜組的足跖厚度分別為3.77mm和3.75mm，與空白對照組之間也達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。由此表明灰棗多糖、多酚和三萜類化合物及其組合均具有增強(qiáng)由 T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用。說明多糖和多糖與多酚組合更可對小鼠因SRBC 引起的遲發(fā)型過敏反應(yīng)有促進(jìn)作用。

以上實驗說明多糖、多酚和三萜是灰棗具有免疫作用的主要活性成分。Li Jinwei等[6]的研究表明金絲小棗多糖組分可增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力和抗補(bǔ)體活性，具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。郝婕等[10]的研究表明棗多酚能提高機(jī)體自身免疫能力。Qiao Aimin等[9]的研究表明酸棗三萜類化合物中組分有較高的抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力。從作用機(jī)制上來說，多糖通過與淋巴細(xì)胞表面特異受體結(jié)合，影響淋巴細(xì)胞的信息傳遞過程，進(jìn)而影響淋巴細(xì)胞基因表達(dá)和淋巴細(xì)胞功能；多酚可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增殖，影響細(xì)胞因子的分泌，從而影響機(jī)體細(xì)胞因子的含量；三萜類化合物能有效地抑制補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑[26]。棗的水提物能抑制IL-1β和IL-6的表達(dá)，但不抑制脂多糖中的TNF-α刺激巨噬細(xì)胞。IL-1β和IL-6在mRNA和蛋白水平受棗水提物的抑制。棗的雙向免疫調(diào)節(jié)作用是通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)實現(xiàn)的[27]。

圖4 灰棗3 種活性成分及其組合對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響Fig. 4 Effect of three bioactive components of Huizao jujubes on DTH

2.5 多糖、多酚和三萜類化合物兩兩組合的免疫交互作用分析

表1 多糖、多酚和三萜類化合物兩兩組合的免疫交互作用Table 1 Combined effects of three bioactive components on immune parameters

對三個組合的交互免疫作用的分析結(jié)果如表1所示，在小鼠體內(nèi)免疫實驗中，多糖與多酚合用后，其各個免疫指標(biāo)（脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、HC50、吞噬指數(shù)α、足跖厚度）均顯著高于單獨使用的加和，說明該組合在小鼠免疫實驗中產(chǎn)生了協(xié)同作用；多糖與三萜類化合物的組合則與之相反，其合用后的吞噬指數(shù)α（7.02）和足跖厚度（3.77mm）顯著小于理論上兩種物質(zhì)單獨使用之和（7.16和3.83mm），說明該組合在小鼠免疫實驗中產(chǎn)生了拮抗作用；多酚與三萜類化合物組合的各個免疫指標(biāo)的理論值和實際值未呈現(xiàn)顯著性差異，表明該組合在小鼠免疫實驗中呈現(xiàn)出加和作用。從作用機(jī)制上來說，多糖和多酚其作用的途徑不同，可以同時起作用，可互相增強(qiáng)對方的免疫作用，從而提高組合的整體免疫活性；多糖與三萜類化合物作用機(jī)制相似，兩者存在競爭，且三萜類化合物也具有一定的負(fù)面影響，如一定的毒性，易與鐵、鋅、鈣形成難溶的復(fù)合鹽[28]，從而降低了其組合的整體免疫活性，有關(guān)灰棗多糖、多酚和三萜類化合物的免疫交互作用機(jī)制有待深入研究闡明。

3 結(jié) 論

阿克蘇灰棗多糖、多酚和三萜類化合物3 種活性成分及其組合免疫實驗表明，灰棗多糖、多酚和三萜類化合物均可顯著提高小鼠體內(nèi)免疫實驗的免疫指標(biāo)，即免疫器官指數(shù)、HC50、吞噬指數(shù)α以及小鼠足跖厚度，具有增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫的作用，灰棗多糖增強(qiáng)免疫活性作用最強(qiáng)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別為3.48 mg/g和2.15 mg/g，吞噬指數(shù)α為3.67，HC50值為0.59，足趾厚度為1.96 mm。3 個成分組合中，灰棗多糖與多酚組合增強(qiáng)免疫活性作用最強(qiáng)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別為7.06 mg/g和4.52 mg/g，HC50為1.27，吞噬指數(shù)α為7.40，足趾厚度為3.99 mm，均顯著高于單獨使用的加和，灰棗多糖與多酚組合能產(chǎn)生協(xié)同免疫作用；多糖與三萜類化合物組合的吞噬指數(shù)α（7.02）和足跖厚度（3.77 mm）顯著小于理論上兩種物質(zhì)單獨使用之和（7.16和3.83 mm），該組合能產(chǎn)生拮抗作用；多酚與三萜類化合物組合的各個免疫指標(biāo)的理論值和實際值未呈現(xiàn)顯著性差異，該組合呈現(xiàn)出加和免疫作用。

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