王鵬 宋偉正 毛慶 陳米娜 劉艷輝

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種具有高度惡性和侵襲性的腦腫瘤，2年及5年生存率僅為26﹪～ 33﹪和4﹪～ 5﹪[1]。目前已有大量研究證實(shí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中存在著分化的腫瘤細(xì)胞和一部分未分化的干（祖）樣細(xì)胞—膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，后者是導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)化治療后腫瘤復(fù)發(fā)和患者預(yù)后不佳的重要原因[2]。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的概念不僅是基于對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察，而且更是基于對(duì)細(xì)胞功能的測(cè)定，對(duì)這種細(xì)胞的分離和研究需要依賴于一些特異的分子標(biāo)志物。國(guó)外有學(xué)者提出乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）可作為篩選膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的功能性分子標(biāo)記[3]，但有學(xué)者卻觀察到ALDH1表達(dá)于成熟的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，是細(xì)胞分化的標(biāo)志，對(duì)其干細(xì)胞標(biāo)記作用提出質(zhì)疑[4]。在國(guó)內(nèi)，筆者首先報(bào)道了在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中ALDH1蛋白僅表達(dá)于分化前的細(xì)胞[5]，但因該研究只進(jìn)行定性觀察，缺乏一定說服力。本實(shí)驗(yàn)擬通過設(shè)立對(duì)照組并應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色和Western blot半定量分析進(jìn)一步探討ALDH1蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的關(guān)系。

材料和方法

一、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)本

收集9例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤實(shí)體組織進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，獲取CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)本。具體方法詳見筆者以往的報(bào)道[5]及參考文獻(xiàn)[14]。實(shí)驗(yàn)計(jì)劃上報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬入院時(shí)均簽訂醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)告知書。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）試劑和設(shè)備

1.主要試劑：Neurobasal培養(yǎng)基、Accutase細(xì)胞消化液、N-2、B-27、熒光二抗和DAPI封片劑（美國(guó)Invitrogen公司）；胎牛血清（鄭州佰安生物工程公司）；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液（北京索萊寶科技公司），丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），β-巰基乙醇、吐溫-20四甲基乙二胺和過硫酸銨（美國(guó)Bio-rad公司），ALDH1抗體（四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）。

2.主要設(shè)備：恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司），倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司），垂直蛋白電泳儀（美國(guó)Amersham公司），蛋白濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad公司），X膠片顯影機(jī)（美國(guó)Kodak公司），熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

（二）細(xì)胞分組與形態(tài)觀察

將9例CD133+膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分為分化組與對(duì)照組。分化組細(xì)胞采取10﹪胎牛血清誘導(dǎo)，操作過程如下：將2 ml Accutase液加入培養(yǎng)皿中，37 ℃下靜置10 min。收集懸浮的細(xì)胞，以90×g的速度離心5 min。在沉淀內(nèi)加入分化培養(yǎng)基（含10﹪胎牛血清），吹打10次，鋪于皿底，37 ℃下培養(yǎng)。對(duì)照組細(xì)胞繼續(xù)于無血清環(huán)境下傳代培養(yǎng)。鏡下逐日查看各組細(xì)胞的形態(tài)。

（三）免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色

將兩組細(xì)胞行ALDH1熒光抗體染色，具體方法詳見參考文獻(xiàn)[5]。應(yīng)用ImageJ軟件（1.51版）統(tǒng)計(jì)各組標(biāo)本ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞胞漿內(nèi)見可見紅色熒光。

（四）蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）

將兩組細(xì)胞行Western blot，檢測(cè)ALDH1的相對(duì)蛋白含量。具體方法如下：將兩組細(xì)胞移入6孔板中，分別培養(yǎng)5 ～ 7 d。吸出殘液，PBS潤(rùn)洗數(shù)次，每孔加入300 μl裂解液，放置于4 ℃層析柜內(nèi)，輕搖30 min。超聲儀中破碎細(xì)胞3 ～ 4次，充分震蕩，4 ℃下以18 000×g的速度離心20 min。取上清液行SDS-PAGE，初始電壓為80 V，樣品進(jìn)入分離膠后加大電壓至125 V，待溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部時(shí)終止電泳，使用預(yù)染蛋白Marker （SM0671）幫助辨識(shí)條帶的大小?？深A(yù)先使用BCA定量試劑盒和酶標(biāo)分析儀行蛋白定量檢測(cè)以確定上樣量。待蛋白分離后，將凝膠和PVDF膜移入轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)，300 V及300 mA下轉(zhuǎn)膜60 min。取出PVDF 膜，加入5﹪的脫脂乳常溫下作用60 min。加入ALDH1抗體（1:1000），4 ℃低溫層析柜水平搖床放置過夜。TBST液清洗，加入HRP（1:20000）常溫靜置60 min。TBST清洗，加入發(fā)光底物作用2 min，X線顯影機(jī)中曝光。掃描膠片并用ImageJ軟件（1.51版）統(tǒng)計(jì)條帶灰度，以β-actin為內(nèi)參，通過計(jì)算ALDH1灰度與β-actin灰度的比值獲得ALDH1的相對(duì)蛋白含量。

（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

使用SPSS軟件（17.0版）對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad軟件（7.0版）繪制直方圖。其中，ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞率和相對(duì)蛋白含量均以±s表示。兩組間ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞率的比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，兩組間ALDH1相對(duì)蛋白含量的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、光鏡下分化組與對(duì)照組細(xì)胞的特點(diǎn)

分化組細(xì)胞呈完全貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)多樣，無聚集現(xiàn)象（圖1a）；對(duì)照組細(xì)胞呈團(tuán)狀聚集，形態(tài)較為一致，細(xì)胞密度高（圖1b）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察分化組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)

二、分化組與對(duì)照組細(xì)胞ALDH1蛋白的半定量分析

熒光顯微鏡下，分化組細(xì)胞的ALDH1蛋白總體呈陰性表達(dá)（圖2a）；對(duì)照組細(xì)胞的ALDH1蛋白呈明顯陽(yáng)性表達(dá)，熒光主要位于細(xì)胞聚集區(qū)的頂部（圖2b）。柱狀圖分析顯示分化組各細(xì)胞標(biāo)本的ALDH1陽(yáng)性率均低于對(duì)照組（圖3）。其中，分化組平均的ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞率為18.78﹪±6.03﹪，對(duì)照組平均為81.23﹪±3.19﹪，Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)顯示兩組的陽(yáng)性細(xì)胞率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

圖2 熒光顯微鏡下觀察分化組與對(duì)照組細(xì)胞ALDH1蛋白的表達(dá)（×200）

圖3 分化組與對(duì)照組中各細(xì)胞標(biāo)本ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞率的比較

Western blot結(jié)果顯示對(duì)照組在膠片55 kDa水平處可見ALDH1蛋白條帶，分化組此處條帶明顯減弱或消失（圖4）。經(jīng)掃描及以β-actin為內(nèi)參計(jì)算灰度比值，分化組的ALDH1相對(duì)蛋白含量為0.035±0.009，對(duì)照組為 0.390±0.108，配對(duì)樣本t檢驗(yàn)顯示分化組的ALDH1相對(duì)含量顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 分化組與對(duì)照組細(xì)胞ALDH1蛋白的表達(dá)情況（±s）

表1 分化組與對(duì)照組細(xì)胞ALDH1蛋白的表達(dá)情況（±s）

圖4 Western blot檢測(cè)分化組與對(duì)照組細(xì)胞的ALDH1相對(duì)蛋白含量

討 論

ALDH1是一種細(xì)胞質(zhì)酶，相對(duì)分子質(zhì)量為55 kDa，包括 ALDH1A1、ALDH1A2和 ALDH1A3 3 個(gè)亞型[6]。其中，ALDH1A1是優(yōu)勢(shì)亞型，ALDH1主要通過其發(fā)揮生理作用[7]。目前的研究表明ALDH1是多種不同來源的腫瘤干（祖）細(xì)胞通用的功能性分子標(biāo)記[8-11]。在神經(jīng)腫瘤中，筆者以往的研究通過定性觀察發(fā)現(xiàn)ALDH1僅表達(dá)于未分化的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞[5]，國(guó)外學(xué)者Rasper等[3]和Choi等[12]也指出多種顱內(nèi)原發(fā)腫瘤中存在著ALDH高表達(dá)的腫瘤原始細(xì)胞，這種ALDH1+細(xì)胞具有腦腫瘤干細(xì)胞的特性。但是德國(guó)學(xué)者Adam等[4]卻觀察到ALDH1A1在成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞和分化的膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞中有著強(qiáng)烈的表達(dá)，標(biāo)志著細(xì)胞分化，對(duì)ALDH1可作為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物提出疑問。

為進(jìn)一步分析ALDH1蛋白表達(dá)與細(xì)胞分化的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞為研究對(duì)象，采用10﹪的胎牛血清對(duì)其中一部分細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，并以繼續(xù)在無血清條件下培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照。胎牛血清可使神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生一定傾向性分化，細(xì)胞迅速貼壁并快速增殖，原有特性消失，形成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。在含5﹪和10﹪胎牛血清的培養(yǎng)基中，神經(jīng)干（祖）細(xì)胞增殖減少并明顯向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化[13]。本研究中，分化組細(xì)胞經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)后表現(xiàn)出了明顯的異質(zhì)性，形態(tài)顯著改變，外形多樣，完全貼壁生長(zhǎng)，無聚集現(xiàn)象，這與Zhou等[14]報(bào)道的結(jié)果相似。對(duì)照組細(xì)胞則繼續(xù)呈團(tuán)狀聚集，形態(tài)較為一致，細(xì)胞密度高，呈現(xiàn)出干細(xì)胞樣生長(zhǎng)的特點(diǎn)。

在ALDH1蛋白檢測(cè)中，免疫熒光染色的結(jié)果顯示分化組內(nèi)僅個(gè)別細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見微量的蛋白熒光。而對(duì)照組中，多數(shù)細(xì)胞的胞漿內(nèi)均可見中量至大量的蛋白熒光，熒光主要集中于細(xì)胞聚集區(qū)的頂部，底部及周邊區(qū)域細(xì)胞熒光有所減弱，這可能因?yàn)橘N壁培養(yǎng)下聚集區(qū)底部及周邊區(qū)域的細(xì)胞存在著一定分化[15]。柱狀圖分析顯示分化組各細(xì)胞標(biāo)本的ALDH1陽(yáng)性率均低于對(duì)照組，說明兩組細(xì)胞ALDH1蛋白的表達(dá)在各標(biāo)本間不存在不一致性。Western blot的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)對(duì)照組各細(xì)胞標(biāo)本均顯著表達(dá)ALDH1蛋白，實(shí)驗(yàn)中可在55 kDa水平處發(fā)現(xiàn)明顯的蛋白條帶；而分化后細(xì)胞的ALDH1表達(dá)降低，其55 kDa水平的條帶顯影減弱，個(gè)別甚至觀察不到。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分化組的ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞率和相對(duì)蛋白含量均顯著低于對(duì)照組。

上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ALDH1蛋白表達(dá)在分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有明顯下降，與Adam等[4]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。筆者認(rèn)為產(chǎn)生這一差異的原因可能有：（1）Adam等的研究直接檢測(cè)了腫瘤組織ALDH1的表達(dá)情況，而本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，二者細(xì)胞所處的微環(huán)境存在不同，可能影響了細(xì)胞表型。（2）盡管實(shí)驗(yàn)均使用單克隆抗體，但不排除交叉反應(yīng)等抗體的非特異性結(jié)合仍在一定程度上干擾了研究結(jié)果。（3）Adam等的實(shí)驗(yàn)僅應(yīng)用了免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織蛋白表達(dá)，缺乏其他蛋白檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步驗(yàn)證。以上問題的答案還有待于后續(xù)的研究來揭示。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)半定量分析了在不同培養(yǎng)環(huán)境下膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的ALDH1蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步證實(shí)了ALDH1蛋白主要表達(dá)于未分化細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的ALDH1含量呈顯著下降，提示在體外研究中ALDH1主要存在于較為原始的腫瘤細(xì)胞，作為可能的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞標(biāo)志物仍有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

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