謝長(zhǎng)峰 馬煒 彭浩 楊曉菲 曾桂芳 劉云城 劉沐蕓,4 胡祥

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cordderived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）由于其獨(dú)特的免疫學(xué)表型，不表達(dá)HLA-Ⅱ類分子和共刺激分子，不引起同種異體淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[1]，因而移植入宿主體內(nèi)的MSCs可避免宿主的免疫排斥，通過細(xì)胞間相互作用和旁分泌等作用抑制過度活躍的T細(xì)胞增殖及過度免疫[2]，從而達(dá)到免疫重建的作用，進(jìn)而為臨床上應(yīng)用于自身免疫病提供了理論基礎(chǔ)。軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)hUCMSCs在體外無致瘤性，體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)hUCMSCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖沒有影響[3]。hUCMSCs對(duì)裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)沒有促進(jìn)作用，不同代次的hUCMSCs接種于免疫缺陷鼠也不具有致瘤性[4]。這些研究為hUCMSCs的臨床應(yīng)用提供了重要的安全性數(shù)據(jù)，但hUCMSCs的體內(nèi)過程究竟如何，目前所知尚少。本研究采用一種親脂性近紅外熒光染料DiR標(biāo)記hUCMSCs，探索hUCMSCs給藥后在小鼠體內(nèi)的分布情況，為闡釋hUCMSCs的體內(nèi)過程提供基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

注射用hUCMSCs（深圳市北科生物科技有限公司，批號(hào)：1280200012502000）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；久保田5120離心機(jī)（日本久保田公司）；熒光染料DiR（美國(guó)Caliber life Science公司，批號(hào) 13D0708-15339）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；IVIS Spectrum小動(dòng)物活體成像儀（美國(guó)PerkinElmer公司）；雄性SPF級(jí)Balb/c裸小鼠（18 ～ 22 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：44007200042000）；動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中的IVC籠內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為BK-2017-01。

二、方法

1. hUCMSCs熒光標(biāo)記：DiR染料以無水乙醇配制成5 mmol/L貯存液，分裝，-20℃凍存，臨用時(shí)取出解凍復(fù)溫后使用。以貼壁法[3]制備hUCMSCs，以生理鹽水配制成2×107個(gè)/ml，加入DiR染料使其終濃度為 300 μmol/L[5]，置于 37 ℃、5 ﹪ CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min，300×g 10 min離心2次，棄上清液，以生理鹽水重懸為1×107個(gè)/ml。

2.生長(zhǎng)曲線：細(xì)胞接種于96孔板，分別于0，24，48，72，96，120 h 以 MTT 比色法[6]測(cè)定 DiR 標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs的生長(zhǎng)曲線，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

3.細(xì)胞表面抗原流式分析：對(duì)DiR標(biāo)記后體外培養(yǎng)3 d和未標(biāo)記hUCMSCs的細(xì)胞表面抗原進(jìn)行流式分析[3]。

4.多向誘導(dǎo)分化：對(duì)DiR標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs進(jìn)行成骨、成脂、成軟骨定向誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)[3]。

5.給藥：實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射給予DiR標(biāo)記hUCMSCs 2×106個(gè)/只，對(duì)照組給予生理鹽水0.2 ml。

6.活體成像：給藥小鼠采用5﹪戊巴比妥鈉0.2 ml/只腹腔注射麻醉。分別于細(xì)胞注射后15 min、4 h、24 h、48 h、72 h、1 周、2 周、4 周進(jìn)行動(dòng)物活體成像，并于 15 min、4 h、24 h、48 h、72 h、1 周、4 周處死部分動(dòng)物，取心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行器官成像。采用710 nm波長(zhǎng)激發(fā)，760 nm波長(zhǎng)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、DiR染色后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況

培養(yǎng)期間，DiR標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs均貼壁生長(zhǎng)，胞體呈長(zhǎng)梭形或扁平狀，細(xì)胞呈旋渦狀生長(zhǎng)。在培養(yǎng)的 0、24、48、72、96 和 120 h，MTT 法測(cè)得的DiR標(biāo)記hUCMSCs和未標(biāo)記hUCMSCs的細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，P ＞ 0.05），二者生長(zhǎng)曲線基本重合。

二、細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果顯示，DiR標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs均強(qiáng)表達(dá) CD90、CD73、CD105，弱表達(dá)CD45、CD34、CD79a、CD14 和 HLA-DR（圖1 ～ 2）。

三、DiR染色后的hUCMSCs多向誘導(dǎo)分化結(jié)果

成骨誘導(dǎo)分化的第28天，DiR標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs組在倒置顯微鏡下均可觀察到細(xì)胞間鈣化基質(zhì)的沉積（圖3c，圖3b），未加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的對(duì)照組未見細(xì)胞間鈣質(zhì)沉積（圖3a）。

表1 細(xì)胞接種后不同時(shí)間DiR標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs細(xì)胞增殖的MTT比色法檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表1 細(xì)胞接種后不同時(shí)間DiR標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs細(xì)胞增殖的MTT比色法檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

圖1 未標(biāo)記hUCMSCs免疫表型細(xì)胞流式檢測(cè)

圖2 DiR標(biāo)記hUCMSCs免疫表型細(xì)胞流式檢測(cè)

成脂誘導(dǎo)分化的第21天，DiR標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs組在倒置顯微鏡下均可觀察到細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴形成（圖4c，圖4b），未加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基的對(duì)照組未見脂滴形成（圖4a）。

成軟骨誘導(dǎo)分化的第21天，DiR標(biāo)記和未標(biāo)記hUCMSCs組在倒置顯微鏡下均可觀察到細(xì)胞間藍(lán)色軟骨基質(zhì)的明顯沉積（圖5c，圖5b），未加成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的對(duì)照組細(xì)胞間藍(lán)色斑塊沉積不明顯（圖5a）。

圖3 倒置顯微鏡下觀察DiR標(biāo)記hUCMSCs的成骨誘導(dǎo)分化（茜素紅染色，×100）

圖4 倒置顯微鏡下觀察DiR標(biāo)記hUCMSCs的成脂誘導(dǎo)分化（油紅O染色，×400）

圖5 倒置顯微鏡下觀察DiR標(biāo)記hUCMSCs的成軟骨誘導(dǎo)分化（阿爾辛藍(lán)染色，×100）

四、熒光成像結(jié)果

DiR標(biāo)記hUCMSCs尾靜脈注射給藥后，15 min裸鼠背側(cè)和腹側(cè)成像均可見胸部強(qiáng)烈熒光，器官成像結(jié)果顯示熒光主要集中在肺臟；4 h裸鼠背側(cè)和腹側(cè)成像均可見胸部和上腹部強(qiáng)烈熒光，器官成像結(jié)果顯示熒光主要集中在肺臟和肝臟；24 h裸鼠背側(cè)和腹側(cè)成像均可見胸部和上腹部強(qiáng)烈熒光，器官成像結(jié)果顯示熒光主要集中在肺臟、肝臟和脾臟；48 h裸鼠背側(cè)成像可見頸部以下較強(qiáng)彌漫性分布熒光，腹側(cè)成像可見熒光主要集中在胸、腹部，器官成像結(jié)果表明熒光主要集中在肺臟、肝臟和脾臟；72 h裸鼠背側(cè)成像可見頭頸部散在熒光及胸腹部較強(qiáng)彌漫性分布熒光，腹側(cè)成像可見小鼠口鼻、前肢趾爪、后肢上部、尿道口及肛周散在較弱熒光，胸、腹部可見較強(qiáng)熒光，器官成像結(jié)果表明熒光主要集中在肺臟、肝臟和脾臟，腸道內(nèi)容物呈藍(lán)黑色，未顯示出熒光；1周裸鼠背側(cè)和腹側(cè)成像均可見胸腹部熒光，器官成像結(jié)果表明熒光主要集中在肝臟、肺臟和脾臟；4周裸鼠背側(cè)和腹側(cè)成像均未見熒光，器官成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟、脾臟和肺臟仍有熒光存在；對(duì)照組無論哪個(gè)時(shí)間背側(cè)、腹側(cè)還是器官成像均無熒光（圖6）。

圖6 DiR標(biāo)記hUCMSCs注射給藥后小鼠熒光成像

討 論

干細(xì)胞示蹤一直是個(gè)世界范圍內(nèi)的難題。目前的干細(xì)胞標(biāo)記示蹤方法主要有Hoechst和Dil等胞漿標(biāo)記物，胸腺嘧啶同位素、5-溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記等核酸標(biāo)記物，插入細(xì)胞并表達(dá)特異性標(biāo)志物的報(bào)告基因標(biāo)記，Y染色體標(biāo)記示蹤、常染色體標(biāo)記示蹤、循環(huán)細(xì)胞標(biāo)記示蹤、光學(xué)成像、核醫(yī)學(xué)分子顯像活體示蹤及磁共振細(xì)胞成像活體示蹤等細(xì)胞標(biāo)記和成像技術(shù)[7-8]。各種標(biāo)記示蹤方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。

DiR是一種親脂性熒光染料，染色標(biāo)記方法簡(jiǎn)單易行。染色時(shí)DiR插入細(xì)胞膜磷脂雙分子層，在整個(gè)細(xì)胞膜上擴(kuò)散，可使整個(gè)細(xì)胞膜染色，710 nm波長(zhǎng)激發(fā)后發(fā)射760 nm近紅外熒光，可與動(dòng)物皮毛、肌肉的自發(fā)熒光區(qū)分開來，從而可用于細(xì)胞的小動(dòng)物體內(nèi)示蹤[5]。DiR標(biāo)記細(xì)胞分裂時(shí)，染料隨細(xì)胞膜被平均分配給分裂的子代細(xì)胞；染色后，DiR染料不在標(biāo)記細(xì)胞與非標(biāo)記細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移；DiR標(biāo)記細(xì)胞的裂解物也不會(huì)在動(dòng)物特定部位顯示熒光[9]。這些特性使得DiR成為細(xì)胞活體示蹤的一種優(yōu)秀染料。

本實(shí)驗(yàn)采用DiR標(biāo)記hUCMSCs注射給藥后研究hUCMSCs在Balb/c裸鼠體內(nèi)的分布行為。DiR標(biāo)記hUCMSCs與未標(biāo)記hUCMSCs在體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)行為一致；DiR標(biāo)記對(duì)細(xì)胞流式常用的PE、FITC、APC、PerCP熒光染料檢測(cè)結(jié)果沒有明顯干擾，對(duì)hUCMSCs的細(xì)胞表型沒有影響；同時(shí)DiR標(biāo)記也不影響hUCMSCs的多向誘導(dǎo)分化能力。

DiR標(biāo)記hUCMSCs貼壁生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、細(xì)胞表型強(qiáng)表達(dá) CD90、CD73、CD105，弱表達(dá) CD45、CD34、CD79a、CD14和 HLA-DR，具有向成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力，符合國(guó)際干細(xì)胞學(xué)會(huì)對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)要求[10]。

DiR標(biāo)記hUCMSCs尾靜脈注射后，15 min時(shí)熒光主要集中分布在裸鼠的肺部；4 h主要集中分布在肺臟和肝臟，分布濃度肺臟＞肝臟；24 h以后主要分布在肺臟、肝臟及脾臟，分布濃度肺臟＞肝臟 ＞脾臟；48 ～72 h時(shí)，熒光略呈彌漫性分布，裸鼠口鼻、趾、爪、尿道口、肛周及小鼠肢體皮膚均有熒光分布，提示部分標(biāo)記細(xì)胞可能死亡裂解，染料隨呼吸、尿液排泄污染了上述部位，然而內(nèi)容物顏色異常的腸道并未顯示出較強(qiáng)熒光，肝臟顏色變深并顯示強(qiáng)烈熒光，器官分布濃度肺臟＞肝臟＞脾臟；1周和2周活體成像熒光持續(xù)減弱（2周僅做了活體成像，數(shù)據(jù)未列），4周時(shí)大部分動(dòng)物體表已觀察不到熒光，但剖取器官后肺臟、肝臟和脾臟仍有較強(qiáng)熒光，分布濃度肝臟＞脾臟＞肺臟。以上結(jié)果提示，尾靜脈注射后hUCMSCs首先分布在裸鼠的肺部，然后部分細(xì)胞從肺部遷移出來分布到肝臟，再有部分細(xì)胞遷移分布到脾臟，隨時(shí)間推移，肺部hUCMSCs逐漸向肝臟和脾臟遷移和分布，肝臟和脾臟分布逐漸增多，肺臟分布逐漸減少。推測(cè)尾靜脈注射后，hUCMSCs經(jīng)上、下腔靜脈回流到裸鼠心臟，由于hUCMSCs細(xì)胞直徑較大（約15 μm），所以肺循環(huán)時(shí)絕大部分hUCMSCs被截留在肺臟，因而存在明顯的首過效應(yīng)；自肺臟遷移出來的hUCMSCs被肝臟和脾臟內(nèi)皮系統(tǒng)截留形成再次分布，最終hUCMSCs主要?dú)w巢在肝臟、脾臟和肺臟，觀察至第4周時(shí)仍有較多細(xì)胞存活。細(xì)胞在體內(nèi)逐漸被代謝掉，可能肝臟是主要的代謝器官，代謝物隨呼吸、尿液、糞便排出體外。

本研究初步揭示了hUCMSCs靜脈注射后在Balb/C裸鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布及歸巢，但hUCMSCs在分布部位的最終分化和轉(zhuǎn)歸仍不清楚。hUCMSCs具有免疫調(diào)節(jié)能力和組織再生功能，在炎癥微環(huán)境下具有向受損組織趨化的能力[11]，相比正常動(dòng)物，其在疾病模型動(dòng)物的分布應(yīng)有所不同；由于人與小動(dòng)物的毛細(xì)血管及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)不同，人體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)其截流可能較少，因此hUCMSCs在人體的組織分布也應(yīng)有所不同，可能較小動(dòng)物更為分散；此外由于對(duì)炎癥微環(huán)境的趨化，hUCMSCs在患者與健康人的組織分布也應(yīng)有所不同，有可能更多地分布在組織受損部位。未來將開展更多的研究以及更長(zhǎng)時(shí)間的觀察，來進(jìn)一步闡釋hUCMSCs在動(dòng)物甚至人體的體內(nèi)過程。

1 Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells:characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy[J]. J Cell Mol Med, 2004, 8(3):301-316.

2 吳世凱, 丁長(zhǎng)才, 柏蕓等. 成體干細(xì)胞臨床應(yīng)用研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 10(14):2763-2767.

3 曾桂芳, 謝長(zhǎng)峰, 徐紹坤, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及軟瓊脂克隆形成的影響[J/CD]. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版),2016, 6(2):97-104.

4 謝長(zhǎng)峰, 杜杰, 曾桂芳, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)裸鼠的促瘤和致瘤性研究[J/CD]. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版), 2016, 6(6):356-362.

5 Kalchenko V, Shivtiel S, Malina V, et al. Use of lipophilic near-infrared dye in whole-body optical imaging of hematopoietic cell homeing[J]. J Biomed Opt, 2006, 11(5):050507.

6 曾四平. MTT法測(cè)定mir-129對(duì)腎癌細(xì)胞SN12-PM6生長(zhǎng)曲線的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 35(20):2965-2966.

7 段峰, 王茂強(qiáng). 干細(xì)胞標(biāo)記示蹤技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際醫(yī)學(xué)放射學(xué)雜志, 2009, 32(6):563-566.

8 牛艷君, 李瑩, 白仲添, 等. 干細(xì)胞標(biāo)記及示蹤技術(shù)的應(yīng)用研究[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2015, 35(4):528-530.

9 Youniss FM, Sundaresan G, Graham LJ, et al. Near-infrared imaging of adoptive immune cell therapy in breast cancer model using cell membrane labeling[J]. PLoS ONE. 2014, 9(10): e109162

10 Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stem cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotheapy, 2006, 8(4):315-317.

11 Costa MHG, McDevitt TC, Cabral JMS, et al. Tridimensional configurations of human mesenchymal stem/stromal cells to enhance cell paracrine potential towards wound healing processes[J]. J Biotechnol, 2017, 262:28-39.