黃 蓓，劉秀偉，袁 琳，羅迎娣，劉 毅

(河南省化工研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450052)

多肽固相合成中側(cè)鏈上半胱氨酸的巰基必須要預(yù)先被保護(hù)基保護(hù)起來，否則其高親核性的巰基將有可能在接肽過程中發(fā)生?；⑼榛雀狈磻?yīng)[1]。

由半胱氨酸形成的二硫鍵在許多蛋白質(zhì)和多肽中是一類非常重要的結(jié)構(gòu)元素。來自不同物種的各種各樣的肽荷爾蒙、蛋白酶抑制劑、細(xì)胞激素和毒素都攜帶有此二硫鍵的結(jié)構(gòu)元素，以便形成理想的三維結(jié)構(gòu)以及賦予直鏈肽生物活性。為了使這些含有獨特二硫鍵結(jié)構(gòu)的多肽和蛋白類物質(zhì)能被作為潛在藥物候選者且最終真正應(yīng)用到實際治療疾病過程中，大量的研究和優(yōu)化工作已經(jīng)開展[2]。

單個分子內(nèi)的二硫鍵多肽分子的構(gòu)建，常規(guī)的方法都是在反應(yīng)最后一步溶液 中氧化相應(yīng)的半胱氨酸的自由巰基。然而，當(dāng)在多肽分子中構(gòu)建多個二硫鍵時將會遇到一個巨大的挑戰(zhàn)，即如何能保證做到按照分子設(shè)計的那樣清晰明了地構(gòu)建相應(yīng)的二硫鍵，同時還可以高收率的得到目標(biāo)產(chǎn)物。為了解決這個問題就需要在肽鏈合成中選擇合適的保護(hù)基對不同位點的半胱氨酸進(jìn)行正交保護(hù)，通過不同的脫除條件來分步實現(xiàn)相應(yīng)位點二硫鍵的構(gòu)建，最終得到設(shè)計的目標(biāo)產(chǎn)物[3]。

圖1 Phacm 保護(hù)基結(jié)構(gòu)

傳統(tǒng)的半胱氨酸巰基保護(hù)基盡管可以構(gòu)建大多數(shù)的多個二硫鍵，但是其相應(yīng)的保護(hù)基脫除都需要在相對比較苛刻的化學(xué)條件下實現(xiàn)，如強(qiáng)酸、重金屬等。本文介紹了一種近年來發(fā)展起來的利用生物酶在非常溫和條件下就可以脫除的巰基保護(hù)基：S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)，Phacm 保護(hù)基結(jié)構(gòu)如圖1所示[4]。

1 S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)介紹

S-Phenylacetamidomethyl(Phacm)是一種半胱氨酸巰基保護(hù)基，此保護(hù)基可以兼容傳統(tǒng)的兩種多肽合成策略(Boc和Fmoc)。

Phacm與Acm在分子結(jié)構(gòu)上有很大的相似性，因此這兩類保護(hù)基在化學(xué)性質(zhì)上有一定的共通性，例如在標(biāo)準(zhǔn)的多肽合成過程中，這兩類保護(hù)基對相應(yīng)的縮合劑和反應(yīng)溶劑耐受性都很好。此外，Acm的脫除條件也可以被用于脫除Phacm。但另一方面這兩類保護(hù)基在化學(xué)性質(zhì)上也表現(xiàn)出一定的差異性，例如Phacm可以被PGA生物酶在非常溫和的條件下脫除，而PGA生物酶對Acm就沒有任何的效果[5]。

2 Phacm保護(hù)的半胱氨酸衍生物合成方法

經(jīng)典的Phacm保護(hù)的半胱氨酸衍生物合成過程包含這些步驟：1)苯乙腈酸性條件下水解得到相應(yīng)苯乙酰胺；2)苯乙酰胺與甲醛在KOH，70℃條件下反應(yīng)得到相應(yīng)的胺基被羥甲基取代的N-(羥甲基)-2-苯乙酰胺；3)N-(羥甲基)-2-苯乙酰胺與L-半胱氨酸鹽酸鹽在三氟甲磺酸-三氟乙酸-水溶劑中，0℃條件下生成巰基被Phacm保護(hù)的半胱氨酸三氟甲磺酸鹽；4)Phacm保護(hù)的半胱氨酸三氟甲磺酸鹽再與二碳酸二叔丁酯(Boc2O)或者9-芴甲基-N-琥珀酰亞胺基碳酸酯(Fmoc-OSu)反應(yīng)最終得到氨基由Boc保護(hù)的S-Phacm半胱氨酸衍生物或者氨基由Fmoc保護(hù)的S-Phacm半胱氨酸衍生物[6]。Phacm 保護(hù)的半胱氨酸衍生物合成方法如圖2所示。

圖2 Phacm保護(hù)的半胱氨酸衍生物合成方法

3 Phacm保護(hù)基的脫除

為了得到活性目標(biāo)分子，任何的保護(hù)基最終都要被脫除。Phacm作為巰基保護(hù)基也是如此，為了最終得到活性目標(biāo)多肽分子，保護(hù)基Phacm也要最終被從分子結(jié)構(gòu)中脫除。

以上介紹了Phacm保護(hù)基可以被PGA活性酶在非常溫和的條件下專一性的脫去，并且基本不會引起其它的副反應(yīng)發(fā)生。近年來為了更方便地使用和回收PGA活性酶，已經(jīng)發(fā)展了一種將PGA固載在高分子樹脂上的技術(shù)，這種固載的PGA活性酶不僅可以高效地脫除Phacm保護(hù)基，而且也可以很方便的回收，經(jīng)多次利用后仍然具有高效的脫除活性[5]。

Phacm保護(hù)基被PGA活性酶脫除的機(jī)理：PGA活性酶可以在非常溫和的條件下專一性地脫除Phacm保護(hù)基骨架中的苯乙?；⒎纸獬霰揭宜?，剩下的胺甲基保護(hù)的巰基進(jìn)一步水解后，最終游離出含有自由巰基的半胱氨酸的活性肽[7]。PGA脫除Phacm保護(hù)基的機(jī)理如圖3所示。

圖3 PGA脫除Phacm保護(hù)基的機(jī)理

4 Phacm保護(hù)基的兼容性和應(yīng)用

研究表明Phacm保護(hù)的半胱氨酸(Cys(Phacm))在兩種傳統(tǒng)的多肽固相合成策略中(Boc和Fmoc)在常用的肽鏈偶聯(lián)反應(yīng)條件下，如DIEA-CH2Cl2(1∶19)、TFA- CH2Cl2(4∶6)、piperidine-DMF (2∶8)、0.1mol/L TBAF 的DMF溶液和DBU-DMF (1∶19)，室溫25℃反應(yīng)24 h后仍然十分穩(wěn)定，沒有發(fā)現(xiàn)任何的分解或者被脫除情況發(fā)生。

另外，研究也證明Phacm保護(hù)的半胱氨酸 (Cys(Phacm)) 在HF-Anisole 或 p-Cresol (9∶1) 0℃條件下反應(yīng)1 h，以及TFA-Scavengers (Phenol,Ethane-1,2-dithiol,p-Cresol,Anisole) 室溫25℃反應(yīng)2h，這兩種多肽合成策略中最后脫除全部保護(hù)基的條件下也是相對穩(wěn)定的。同時，進(jìn)一步地研究發(fā)現(xiàn)Phacm保護(hù)的半胱氨酸 (Cys(Phacm)) 即使在脫除巰基保護(hù)基Fm的條件下(Piperidine-DMF-β-mercaptoethanol (βME) = 10∶10∶0.7)也是非常穩(wěn)定的[8]。

基于以上的研究數(shù)據(jù)顯示，巰基保護(hù)基Phacm可以在多肽合成中在脫除所有側(cè)鏈保護(hù)基的條件下保留下來，這就給下一步形成不同二硫鍵提供了一個很好的區(qū)位選擇可能性。

由于Phacm保護(hù)基這些獨特的性質(zhì)，此保護(hù)基已經(jīng)在尾加壓素類多肽(Urotensin-related peptide)和催產(chǎn)素類物質(zhì) (Oxytocin analogue) 等其他含有二硫鍵多肽類藥物的合成中取得了很好的效果[9]。

5 結(jié)論及展望

隨著新多肽藥物的發(fā)現(xiàn)和多肽技術(shù)的不斷更新，構(gòu)建更加復(fù)雜多變的分子骨架的需求將會逐漸增加，這就相應(yīng)的要求各種類型的保護(hù)基的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展。近年來，隨著各個學(xué)科的不斷交叉融合，多肽藥物的合成也逐漸出現(xiàn)了與小分子、高分子、聚合物等物質(zhì)結(jié)構(gòu)和學(xué)科的融合，特別是對合成含有多個二硫鍵的多肽藥物，對半胱氨酸保護(hù)基的正交選擇尤為重要。因此尋找、發(fā)現(xiàn)、發(fā)展更加性質(zhì)獨特或者廣譜性的半胱氨酸保護(hù)基也始終是多肽藥物合成研究的重點之一。

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(本文文獻(xiàn)格式：黃蓓，劉秀偉，袁琳，等.半胱氨酸保護(hù)基S-Phenylacetamidomethyl (Phacm)的合成及應(yīng)用[J].山東化工,2018,47(7):51-53.)