不同濃度西紅花苷對RANKL誘導(dǎo)的小鼠破骨細(xì)胞分化的影響

林思思，章禮煒，孫旺，施更生△

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周支持組織的慢性炎癥，是最常見的口腔疾病之一，在世界范圍內(nèi)有較高的患病率［1-3］。牙周炎是造成牙齒過早脫落的首要原因，其中以牙齦炎癥、牙周袋形成、附著喪失、牙槽骨吸收為主要臨床癥狀［4-5］，但目前牙周炎的研究主要以抑制牙菌斑、減少炎癥為主，而針對抑制骨吸收的研究較少。西紅花苷又稱西紅花素，是從我國中藥藏紅花中提取出來的，是西紅花的一種水溶性類胡蘿卜素類化合物西紅花酸與不同糖結(jié)合而成的一系列酯苷［6］。隨著近年來國內(nèi)外對西紅花苷研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)西紅花苷能夠減少骨關(guān)節(jié)炎動物模型的骨退化［7］。然而，西紅花苷對破骨細(xì)胞的直接影響還未被研究清楚，因此本文研究不同濃度的西紅花苷對核因子κB受體激動劑配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞購自恩澤醫(yī)療集團(tuán)公共科研平臺，西紅花苷、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購于Sigma公司，西紅花苷采用去離子水稀釋至儲存濃度（40 mmol/L），青-鏈霉素溶液（100×）、CCK-8試劑盒購于碧云天生物科技有限公司，RANKL購于R&D systems，α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM均購于Gibco公司，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Fermentas公司，F(xiàn)S SYBR Green Master購自上海Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度至70%～80%時(shí)，胰酶消化后按1∶2進(jìn)行傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測不同濃度的西紅花苷對細(xì)胞生長活力的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板，分別取 0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L 的西紅花苷加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃分別孵育48、96 h后，棄上清，按每孔加入5μL CCK-8試劑和95μL DMEM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h后，用Tecan酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞450 nm處的吸光度。

1.2.3 TRAP染色成熟的破骨細(xì)胞 RAW264.7細(xì)胞以4×103個(gè)/孔接種于48孔板，37℃培養(yǎng)箱過夜，加入100 ng/L RANKL 和 0、12.5、50、100μmol/L 的西紅花苷進(jìn)行誘導(dǎo)，每2 d換液1次，第6天用TRAP染色，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，在含有萘酚AS-BI磷酸鹽的孵育液中37℃孵育1 h，用去離子水反復(fù)沖洗3次，蘇木精復(fù)染3 min，PBS沖洗3次，100倍顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并對破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，TRAP陽性細(xì)胞染色呈紫色，有3個(gè)細(xì)胞核以上的巨噬細(xì)胞即為成熟破骨細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR RAW264.7細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于 6 孔板，加入 100 ng/L RANKL 和 0、12.5、50、100μmol/L的西紅花苷進(jìn)行誘導(dǎo)，直至0μmol/L組觀察到破骨細(xì)胞形成。收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)。20μL反應(yīng)體系包含cDNA模板1μL，上、下游引物各0.25μL，ddH2O 8.5μL，SYBR Green 10μL。反應(yīng)條件：50℃預(yù)變性 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在實(shí)時(shí)熒光定量儀ABI 7500上進(jìn)行，以GADPH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析破骨細(xì)胞特異性基因降鈣素受體（CTR）、活化 T 細(xì)胞核因子 1（NFATC1）、C-fos、TRAP的mRNA表達(dá)水平，相應(yīng)的引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

Tab.1 Primers for qRT-PCR表1qRT-PCR引物序列表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西紅花苷對細(xì)胞活性的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，在 0～100μmol/L范圍內(nèi)，西紅花苷對RAW264.7細(xì)胞的生長無明顯影響。當(dāng)西紅花苷濃度≥100μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖活力下降，顯示出明顯的抑制增殖作用，見圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取0～100μmol/L西紅花苷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 西紅花苷對RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7形成破骨細(xì)胞的影響 TRAP染色可觀察到西紅花苷的濃度越高，TRAP染色陽性細(xì)胞越少，抑制RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的作用越明顯，見圖2。

2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果 隨著西紅花苷濃度的升高，破骨細(xì)胞中 CTR、NFATC1、C-fos、TRAP 的mRNA表達(dá)水平逐漸降低，見圖3。

3 討論

牙周病指發(fā)生在牙齦、牙周膜等牙齒支持組織的慢性炎癥性疾?。?］，由于其周期較長，牙周組織的反復(fù)炎癥可以造成附著喪失和牙槽骨的吸收［9］，當(dāng)牙齦中的慢性炎癥向深部牙周組織擴(kuò)展到牙槽骨附近時(shí)，骨表面和骨髓腔內(nèi)分化出破骨細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞，發(fā)生陷窩狀骨吸收，或使骨小梁變細(xì)，骨髓腔增大，破骨細(xì)胞和單核細(xì)胞是與骨吸收相關(guān)的兩種細(xì)胞部分。牙槽骨吸收是牙周炎的一個(gè)主要病理變化，由于牙槽骨的吸收，使牙齒的支持組織喪失，牙齒早期脫落，并且可以造成缺牙區(qū)牙槽骨寬度不夠、上頜竇底較低、下牙槽神經(jīng)管較近等問題，不利于后期缺牙區(qū)種植修復(fù)。牙周炎的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，但是目前研究已知牙菌斑微生物是引起牙周炎的重要因素［10］。牙菌斑微生物可以引起牙齦炎癥，而宿主免疫炎癥反應(yīng)在對抗細(xì)菌感染時(shí)產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶、致炎因子、前列腺素等炎癥介質(zhì)是導(dǎo)致牙周組織破壞的主要因素［11-13］。而目前治療牙周炎的藥物大多都是針對抑制炎癥介質(zhì)，較少研究抑制骨吸收的藥物。因此，本文選用研究藥物抑制骨吸收具有一定的創(chuàng)新性。

Fig.1 The effects of 0-400μmol/L of crocin on the viability of RAW264.7 cells圖1 0～400μmol/L西紅花苷對RAW264.7細(xì)胞生長活力的影響

Fig.2 The effects of different concentrations of crocin on receptor activator of RANKL-induced osteoclastogenesis圖2 不同濃度西紅花苷對RANKL誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞的影響

Fig.3 The effects of different concentrations of crocin on expression levels of TRAP,CTR,NFATC1 and C-fos mRNA圖3 不同濃度西紅花苷對破骨細(xì)胞TRAP、CTR、NFATC1、C-fos mRNA表達(dá)的影響

西紅花又稱藏紅花，是一種鳶尾科番紅花屬的多生花卉，其藥用部位為西紅花的干燥柱頭，是我國傳統(tǒng)中藥材。西紅花苷是西紅花中提取物之一，主要存在于西紅花中的非四萜類色素，包括西紅花苷-1、西紅花苷-2、西紅花苷-3、西紅花苷-4和西紅花酸，均是胡蘿卜烯類化合物在植物體內(nèi)的氧化產(chǎn)物［14］。近幾年研究表明，西紅花苷具有明顯的抗腫瘤、保護(hù)心血管的功效［15-16］。Hire 等［15］發(fā)現(xiàn)西紅花苷可以通過抑制細(xì)胞的有絲分裂從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。Ghorbanzadeh等［16］研究發(fā)現(xiàn)，西紅花苷可以通過提高miR-126和miR-210的表達(dá)、激活蛋白激酶B（Akt）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）信號通路而促進(jìn)大鼠心臟血管生成，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。隨著對西紅花苷研究的逐漸深入，Hemshekhar等［7］發(fā)現(xiàn)西紅花苷可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、MMP-9、透明質(zhì)酸酶和非酶類如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-1b、NF-κB等水平和改善抗氧化能力而緩解小鼠軟骨和骨退化。國內(nèi)Cao等［17］發(fā)現(xiàn)西紅花苷可通過抑制無機(jī)礦物質(zhì)的流失，而減少骨質(zhì)疏松的發(fā)生，同時(shí)西紅花苷濃度越高，抑制破骨細(xì)胞形成的效果越明顯。因此本研究將不同濃度（0～400μmol/L）的西紅花苷加入RAW264.7細(xì)胞中，用CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選出適宜的西紅花苷實(shí)驗(yàn)濃度，然后在一定濃度內(nèi)（0～100μmol/L）證實(shí)了西紅花苷的濃度越高，RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)分化成破骨細(xì)胞的數(shù)量越少，同時(shí)破骨細(xì)胞的特異性基因CTR、NFATC1、C-fos、TRAP mRNA表達(dá)量越少，提示在一定濃度范圍內(nèi)，西紅花苷濃度越高，抑制破骨細(xì)胞形成的效果越明顯。本研究為西紅花苷用于牙周炎的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，今后應(yīng)進(jìn)一步觀察西紅花苷對成骨細(xì)胞的影響及機(jī)制。

［1］Hong JW，Noh JH，Kim DJ.The Prevalence and associated factors of periodontitis according to fasting plasma glucose in the korean adults：The 2012-2013 Korea National Health and Nutrition Examination Survey［J］.Medicine（Baltimore），2016，95（14）：e3226.doi：10.1097/MD.0000000000003226.

［2］Eke PI，Dye BA，Wei L，et al.Update on prevalence of periodontitis in adults in the United States：NHANES 2009 to 2012［J］.J Periodontol，2015，86（5）：611-622.doi：10.1902/jop.2015.140520.

［3］Zhang Q，Li ZX，Wang CX，et al.Prevalence and predictors for periodontitis among adults in China，2010［J］.Global Health Action，2014，7：24503.doi：10.3402/gha.v7.24503.

［4］Hajishengallis G.Periodontitis：from microbial immune subversion to systemic inflammation［J］.Nat Rev Immunol，2015，15（1）：30-44.doi：10.1038/nri3785.

［5］Mariotti A，Hefti AF.Defining periodontal health［J］.BMC Oral Health，2015，15（Suppl 1）：S6.doi：10.1186/1472-6831-15-S1-S6.

［6］Alavizadeh SH，Hosseinzadeh H.Bioactivity assessment and toxicity of crocin：a comprehensive review［J］.Food Chem Toxicol，2014，64：65-80.doi：10.1016/j.fct.2013.11.016.

［7］Hemshekhar M，Sebastin SM，Sunitha K，et al.A dietary colorant crocin mitigates arthritis and associated secondary complications by modulating cartilage deteriorating enzymes，inflammatory mediators and antioxidant status［J］.Biochimie，2012，94（12）：2723-2733.doi：10.1016/j.biochi.2012.08.013.

［8］Highfied J.Diagnosis and classification of periodontal disease［J］.Aust Dent J，2009，54（Suppl 1）：S11-26.doi：10.1111/j.1834-7819.2009.01140.x.

［9］Lindberg TY，B?ge T.Inflammatory mediators in the pathogenesis of periodontitis［J］.Expert Rev Mol Med，2013，15：e7.doi：10.1017/erm.2013.8.

［10］Albandar JM.Global risk factors and risk indicators for periodontal diseases［J］.Periodontology，2000，29：177-206.doi：10.1034/j.1600-0757.2002.290109.x.

［11］Silosi I，Cojocaru M，F(xiàn)oia L，et al.Significance of circulating and crevicular matrix metalloproteinase-9 in rheumatoid arthritischronic periodontitis association［J］.J Immunol Res，2015，2015：218060.doi：10.1155/2015/218060.

［12］Bostr?m EA，Kindstedt E，Sulniute R，et al.Increased eotaxin and MCP-1 levels in serum from individuals with periodontitis and in human gingival fibroblasts exposed to pro-inflammatory cytokines［J］.PLoS One，2015，10（8）：e0134608.doi：10.1371/journal.pone.0134608.

［13］Trindade F，Oppenheim FG，Helmerhorst EJ，et al.Uncovering the molecular networks in periodontitis［J］.Proteomics Clin Appl，2014，8（9/10）：748-761.doi：10.1002/prca.201400028.

［14］Inoue E，Shimizu Y，Masui R，et al.Effects of saffron and its constituents，crocin-1，crocin-2，and crocetin on α -synuclein fibrils［J］.J Nat Med，2018,72（1）:274-279.doi：10.1007/s11418-017-1150-1.

［15］Hire RR，Srivastava S，Davis MB，et al.Antiproliferative activity of crocin involves targeting of microtubules in breast cancer cells［J］.Sci Rep，2017，7：44984.doi：10.1038/srep44984.

［16］Ghorbanzadeh V，MohammadiM，Dariushnejad H，etal.Cardioprotective effect of crocin combined with voluntary exercise in rat：role of Mir-126 and Mir-210 in heart angiogenesis［J］.Arq Bras Cardiol，2017，109（1）：54-62.doi：10.5935/abc.20170087.

［17］Cao PC，Xiao WX，Yan YB，et al.Preventive effect of crocin on osteoporosis in an ovariectomized rat model［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：815181.doi：10.1155/2014/825181.