孫正陽，呂廣新，孟浩毅，趙晨，楊兆勇，陳靜

波拉霉素（圖 1）是吸水鏈霉菌 LP93（Streptomyces hygroscopicusLP93）發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)酸化、過濾，菌體用溶劑提取、層析等方法分離提取得到的具有很高抗真菌活性的多羥基內(nèi)酯類新抗生素[1]。該抗生素是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所首次發(fā)現(xiàn)的一種新結(jié)構(gòu)天然抗菌化合物，具有廣譜抗微生物活性，對酵母菌、絲狀真菌、原蟲、革蘭陽性細(xì)菌均有活性，是一類廣譜抗真菌抗生素[2]。另外，其產(chǎn)生菌原始菌株的生物學(xué)效價已穩(wěn)定達(dá)到 3000 μg/ml，具有較好的應(yīng)用價值。因此，建立波拉霉素商品化生產(chǎn)的小型中試發(fā)酵工藝對于其應(yīng)用技術(shù)的研究是十分關(guān)鍵的。

本研究通過對波拉霉素發(fā)酵培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以枯草芽孢桿菌為檢定菌株進(jìn)行波拉霉素發(fā)酵液活性測定，獲得最優(yōu)的發(fā)酵條件，以利于提高其生物學(xué)效價，為波拉霉素的應(yīng)用研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 波拉霉素結(jié)構(gòu)圖Figure 1 The structure of polaramycin

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 超凈工作臺購自蘇州匯通空調(diào)凈化工程有限公司；CR22GIII 型高速離心機(jī)購自日本 Hitachi 公司；高壓滅菌鍋購自日本 Hirayama公司；ZHWY-3212 自控?fù)u床、37 ℃ 和 28 ℃ 培養(yǎng)箱均購自上海智城分析儀器制造有限公司；電子天平購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.1.2 產(chǎn)生菌和培養(yǎng)基 波拉霉素產(chǎn)生菌、枯草芽孢桿菌 63501 由本實(shí)驗(yàn)室保存；斜面培養(yǎng)基：天門冬素 0.05%、K2HPO40.05%、葡萄糖 1%、瓊脂 1.2%；種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉 2% ～ 4%、(NH4)2SO40.3%、CaCO30.15%、葡萄糖 2%；基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1（用于進(jìn)行氮源及輔助氮源的優(yōu)化）：葡萄糖 3.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2（用于進(jìn)行碳源的優(yōu)化）：黃豆餅粉 3.0%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；發(fā)酵培養(yǎng)基（用于進(jìn)行消泡劑添加及發(fā)酵中補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)）：黃豆餅粉 3.0%、葡萄糖 3.5%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.5%、CaCO30.3%；檢定培養(yǎng)基 I（上層）：蛋白胨 0.5%、牛肉浸出粉 0.5%、NaCl 0.8%、Na2HPO40.2%、瓊脂 1%、pH 7.0；檢定培養(yǎng)基 II（下層）：蛋白胨 0.5%、牛肉浸出粉 0.5%、NaCl 0.8%、Na2HPO40.2%、瓊脂2%，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵方法 取新鮮波拉霉素產(chǎn)生菌斜面，采用挖塊法接種于裝有 50 ml 種子培養(yǎng)基的250 ml 三角瓶中，于 28 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng) 48 h，再以體積分?jǐn)?shù) 10% 的接種量接入裝有50 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 ml 三角瓶中，于 25 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 波拉霉素活性測定

1.2.2.1 雙碟的制備 取直徑約 90 mm、高 16 ～17 mm 的平底雙碟，注入加熱融化的檢定培養(yǎng)基 II 20 ml，使其在碟底均勻攤布，放置水平臺上凝固，以此作為底層。另取檢定培養(yǎng)基 I 適量加熱融化后，放冷至 48 ～ 50 ℃，加入 1% 枯草芽孢桿菌菌懸液，充分搖勻后用滅菌大口吸管在每個雙碟中分別加入 5 ml，使其在底層上均勻攤布，作為菌層，放置水平臺上冷卻后備用。

1.2.2.2 波拉霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵液的活性測定 精密吸取波拉霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵液1 ml，加入 1 ml 乙酸乙酯，充分混勻，取乙酸乙酯提取液進(jìn)行測定。在每一個雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內(nèi)徑 6.0 mm，高 10.0 mm，外徑 7.8 mm）6 個，加入 200 μl 各組乙酸乙酯提取液，置于 37 ℃ 培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.3 氮源及輔助氮源對波拉霉素發(fā)酵的影響 以原發(fā)酵培養(yǎng)基中添加黃豆餅粉 3.0% 為對照，分別用黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉 3.0% + 玉米漿 1.0%、黃豆餅粉 3.0% + 酵母膏 0.5%、黃豆餅粉 3.0% + 精介蛋白胨 0.5%、魚粉 2.2% + (NH4)2SO40.5%、黃豆餅粉 3.0% + KNO30.5%、黃豆餅粉 3.0% +NH4NO30.2%、黃豆餅粉 3.0% + NH4Cl 0.5%、芝麻餅粉 3.0%、玉米漿 2.0% + (NH4)2SO40.5% 作為氮源及輔助氮源添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1 中，進(jìn)行菌株的發(fā)酵，分別于發(fā)酵 72 h 及 96 h 取樣，測定抑菌活性，確定最適氮源。

1.2.4 碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響 以原發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖 3.5% 為對照，分別用淀粉3.5%、蔗糖 3.5%、乳糖 3.5%、果糖 3.5%、甘油3.5%、糊精 3.5%、豆油 3.5%、玉米粉 3.5%、淀粉 3.0% + 葡萄糖 0.5% 作為碳源添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2 中，進(jìn)行菌株的發(fā)酵，分別于發(fā)酵 72 h 及96 h 取樣，測定抑菌活性，確定最適碳源。

1.2.5 消泡劑對波拉霉素發(fā)酵的影響 以發(fā)酵過程不添加消泡劑為對照，分別用豆油（0.1%、0.3%、0.5%）、泡敵（0.01%、0.03%、0.05%）及豆油 + 泡敵（0.1% + 0.01%、0.3% + 0.03%、0.5% + 0.05%）作為消泡劑添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株的發(fā)酵，分別于發(fā)酵 72 h 及 96 h 取樣，測定抑菌活性，確定消泡劑對波拉霉素發(fā)酵的影響。

1.2.6 波拉霉素發(fā)酵的補(bǔ)料實(shí)驗(yàn) 在波拉霉素發(fā)酵過程中分別在不同發(fā)酵時間補(bǔ)加不同的培養(yǎng)基成分，以發(fā)酵過程不進(jìn)行補(bǔ)料為對照，測定抑菌活性，確定波拉霉素中試發(fā)酵的最佳補(bǔ)料條件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 次及以上的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。所有數(shù)據(jù)均采用 ANOVA 分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05 即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同氮源對波拉霉素發(fā)酵的影響

利用發(fā)酵液抑菌活性評價 12 種不同氮源及輔助氮源對波拉霉素發(fā)酵的影響。結(jié)果如圖 2 所示，發(fā)酵 72 h 時，以花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉3.0% + 玉米漿 1.0%、黃豆餅粉 3.0% + NH4NO30.2% 作為氮源效果最佳。而當(dāng)發(fā)酵 96 h 時，以黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、黃豆餅粉 3.0% +NH4Cl 0.5%、芝麻餅粉 3.0%、花生餅粉 3.0%、黃豆餅粉 3.0% + 精介蛋白胨 0.5% 作為混合氮源添加時，波拉霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵液抑菌活性提高最為明顯。

2.2 不同碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響

由 10 種不同碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響結(jié)果（圖 3）可知，無論是 72 h 還是 96 h，波拉霉素發(fā)酵的碳源以果糖最佳，葡萄糖次之，豆油最差。

2.3 消泡劑對波拉霉素發(fā)酵的影響

結(jié)果如圖 4 所示，從發(fā)酵發(fā)展趨勢可以看出豆油和泡敵添加量為 0.5% 和 0.05% 時對波拉霉素發(fā)酵幾乎無影響。

在考慮以上因素進(jìn)行研究的同時，各組實(shí)驗(yàn)均分別在發(fā)酵 72 h 和 96 h時取樣，對不同發(fā)酵時間進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵 96 h 較 72 h 抑菌活性提高明顯，因此確定波拉霉素的最佳發(fā)酵時間為96 h。

圖2 不同氮源對波拉霉素發(fā)酵的影響Figure 2 The effect of different nitrogen sources on the fermentation of polaramycin

圖3 不同碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響Figure 3 The effect of different carbon sources on the fermentation of polaramycin

圖4 消泡劑的添加對波拉霉素發(fā)酵的影響Figure 4 The effect of adding defoamer on the fermentation of polaramycin

圖5 補(bǔ)料方式對波拉霉素發(fā)酵的影響Figure 5 The effect of feeding method on the fermentation of polaramycin

2.4 波拉霉素發(fā)酵的補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對波拉霉素發(fā)酵過程中的補(bǔ)料方式進(jìn)行了探討，結(jié)果如圖 5 所示，波拉霉素在發(fā)酵 72 h 時補(bǔ)加 1% 葡萄糖和 0.5% 黃豆餅粉效果最佳。

3 討論

氮源在微生物發(fā)酵中起著重要作用，為微生物提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子等重要物質(zhì)，不僅供應(yīng)菌體生長和維持生命活動，還和代謝產(chǎn)物的生物合成密切相關(guān)[3]。黃豆餅粉是初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此本研究對 12 種不同氮源及輔助氮源進(jìn)行考察，綜合考慮中試發(fā)酵成本、穩(wěn)定性及酸堿性等因素，最終以黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5% 作為培養(yǎng)基的最佳氮源。

碳源是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中最重要的能源物質(zhì)之一，它能夠?yàn)槲⑸锏纳L及抗生素的合成提供能量及碳元素，因此對于微生物的生長發(fā)育具有決定性的作用[4]。因此在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察10 種不同碳源對波拉霉素發(fā)酵的影響，綜合考慮中試發(fā)酵工藝，最終以原培養(yǎng)基中葡萄糖 3.5% 作為波拉霉素發(fā)酵的碳源。

在液體發(fā)酵過程中，由于通氣、攪拌、菌液黏稠度逐漸增大以及培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)物積累等原因，發(fā)酵液會產(chǎn)生大量的泡沫[5]，泡沫嚴(yán)重時，極易造成發(fā)酵液漫罐、雜菌污染及代謝異常等不利影響[6]。然而，適當(dāng)?shù)呐菽纬蓪股匕l(fā)酵氧傳遞速率（OTR）的提高有顯著作用，因此篩選適合的消泡劑對泡沫適量控制是波拉霉素發(fā)酵過程中的重要環(huán)節(jié)之一[7]。通常消泡的方法包括物理方法（如機(jī)械攪拌、靜電消泡、冷凍法等）和化學(xué)方法[6]?；瘜W(xué)方法通過消泡劑的添加來減少或控制泡沫，經(jīng)濟(jì)方便且效果好，目前在液體發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用[8]?；瘜W(xué)消泡劑的添加對微生物菌體生長會產(chǎn)生一定影響，可能會降低或抑制發(fā)酵微生物的生長和產(chǎn)量[9]。因此本研究考察兩種不同消泡劑（豆油和泡敵）及不同添加濃度對波拉霉素發(fā)酵的影響，結(jié)果表明添加一定量的豆油和泡敵對波拉霉素發(fā)酵幾乎無影響。

補(bǔ)料培養(yǎng)作為一種介于連續(xù)培養(yǎng)和分批培養(yǎng)之間的發(fā)酵方式，是指在發(fā)酵過程中，連續(xù)或間歇補(bǔ)加一種或幾種培養(yǎng)基成分，但不同時取出發(fā)酵液的發(fā)酵方法[10]。其具有提高菌體對氧和營養(yǎng)成分的利用率、緩和培養(yǎng)基底物抑制等特點(diǎn)，從而更有利于目的產(chǎn)物的生成，達(dá)到較大幅度提高產(chǎn)量的目的，目前已被廣泛應(yīng)用到各種發(fā)酵初級和次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中[11-12]。因此本研究對波拉霉素發(fā)酵過程中的補(bǔ)料方式進(jìn)行了探討，確定了其最佳補(bǔ)料方式。

綜上所述，本研究通過對波拉霉素發(fā)酵培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以枯草芽孢桿菌為檢定菌株進(jìn)行活性測定，確定波拉霉素發(fā)酵最優(yōu)的氮源為黃豆餅粉 3.0% + (NH4)2SO40.5%、最佳碳源為葡萄糖 3.5%、發(fā)酵 72 h 時補(bǔ)加 1% 葡萄糖和 0.5%黃豆餅粉、最終發(fā)酵 96 h，且豆油和泡敵添加量為0.5% 和 0.05% 時對波拉霉素發(fā)酵無影響。本研究為波拉霉素中試發(fā)酵條件的確定提供了依據(jù)，進(jìn)而為其應(yīng)用研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

[1] Meng W, Jin WZ. Structure determination of new antifungal antibiotics, polaramycins A and B. Acta Pharm Sinica, 1997, 32(5):352-356. (in Chinese)孟偉, 金文藻. 新抗生素波拉霉素A和 B的結(jié)構(gòu)測定. 藥學(xué)學(xué)報,1997, 32(5): 352-356.

[2] Jin WZ, Meng W, Wang YG, et al. Polaramycins A and B, novel antifungal antibiotics from Streptomyces hygroscopicus. Isolation,properties and characterization. Chin J Antibiot, 1997, 22(1):1-7. (in Chinese)金文藻, 孟偉, 王以光, 等. 新抗生素波拉霉素 A、B的分離、性質(zhì)及鑒別. 中國抗生素雜志, 1997, 22(1):1-7.

[3] Flugel RS, Hwangbo Y, Lambalot RH, et al. Holo-(acyl carrier protein)synthase and phosphopantetheinyl transfer in Escherichia coli. J Biol Chem, 2000, 275(2):959-968.

[4] Wang ZH. Research on the process optimization of erythromycin fermentation. Zhengzhou: Zhengzhou University, 2014. (in Chinese)王智慧. 紅霉素發(fā)酵工藝優(yōu)化研究. 鄭州: 鄭州大學(xué), 2014.

[5] Qin XW, Chen H, Kuang JB, et al. Application of antifoam to baker' s yeast production. Liquor-Making Sci Technol, 2006, (12):87-89. (in Chinese)覃先武, 陳暉, 匡金寶, 等. 消泡劑在面包酵母生產(chǎn)中的應(yīng)用. 釀酒科技, 2006, (12):87-89.

[6] Ge CC, Wang YS, Yu HW, et al. Study on foam and antifoaming agent.Dev Application Mater, 2010, 25(6):81-84. (in Chinese)葛成燦, 王源升, 余紅偉, 等. 泡沫及消泡劑的研究進(jìn)展. 材料開發(fā)與應(yīng)用, 2010, 25(6):81-84.

[7] Zhou J, Wang JF, Hao YY, et al. Screening for antifoam with high performances based on its physical and physiological effects on the fermentation of biotechmycin. Acta Agric Univ Jiangxiensis, 2008,30(3):543-547. (in Chinese)周建, 王軍峰, 郝玉有, 等. 基于必特螺旋霉素發(fā)酵過程物理和生理作用的消泡劑篩選. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008, 30(3):543-547.

[8] Liu Y, Zhang HR, Zhao L, et al. Screening of the antifoams for fermentation of Sorangium cellulosum. J Qilu Univ Technol, 2014,28(1):5-8. (in Chinese)劉躍, 張紅蕊, 趙林, 等. 纖維堆囊菌發(fā)酵所用消泡劑的篩選. 齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 28(1):5-8.

[9] Ma XM, Wang J, Kuang WF, et al. Effect of organic defoaming agent on conidial spore production of Trichoderma asperellum Trl48c in liquid fermentation process. Chem Bioeng, 2017, 34(3):40-44. (in Chinese)馬曉梅, 王軍, 曠文豐, 等. 有機(jī)消泡劑對棘孢木霉菌株Tr148c液體發(fā)酵分生孢子產(chǎn)量的影響. 化學(xué)與生物工程, 2017, 34(3):40-44.

[10] Wu Y, Liang XF, Liu HZ, et al. Production of nattokinaseby fed-batch fermentation. Food Fermentation Ind, 2018, 44(1):126-132. (in Chinese)吳燕, 梁向峰, 劉會洲, 等. 納豆激酶分批補(bǔ)料發(fā)酵的研究. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2018, 44(1):126-132.

[11] Ren A, Li MJ, Shi L, et al. Profiling and quantifying differential gene transcription provide insights into ganoderic acid biosynthesis in Ganoderma lucidum in response to methyl jasmonate. PLoS One,2013, 8(6):e65027.

[12] Zhong JJ, Xu YN, Tan GY, et al. Signal transduction engineering: a powerful platform technology for enhancing secondary metabolite production. New Biotechnol, 2014, (31S):S23-S24.