常春， 李梅珠， 張賽容， 李濤

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤第2位[1]。近年來，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率逐年增高，地區(qū)差異明顯[2]。結(jié)直腸癌在廣東省梅州客家人中發(fā)病率較高，資料顯示，結(jié)直腸癌在1983—2007年均列住院患者惡性腫瘤第2位[3]。廣東省梅州客家人有著相對特殊的遺傳背景和飲食習(xí)慣，而對廣東省梅州客家人的結(jié)直腸癌病因研究的報(bào)道較少。本研究結(jié)合流行病學(xué)和生物學(xué)方法，從宏觀和微觀來綜合評價(jià)與探討環(huán)境與基因在廣東省梅州客家人中結(jié)直腸癌發(fā)病危險(xiǎn)因素中的交互作用，以便為該人群結(jié)直腸癌的病因研究并為Ⅰ級(jí)預(yù)防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年3 月至2015年7月期間在廣東梅州嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及梅州市人民醫(yī)院經(jīng)過病理診斷的結(jié)直腸癌300例為結(jié)直腸癌組，其中男215例，女85例，年齡36～81歲，平均年齡57.85歲。組織細(xì)胞學(xué)分型：中分化腺癌189例，低分化腺癌111例。臨床分期均為中晚期。其近三代以上(含三代)父系和母系均為居住在梅州市轄區(qū)內(nèi)的客家人。并隨機(jī)抽取300名具有相同基線的體檢健康者作為對照組。其中男206例，女94例，年齡32～79歲，平均年齡53.76歲。本研究通過嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 問卷調(diào)查 采用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的問卷調(diào)查表，由經(jīng)培訓(xùn)的調(diào)查員以問詢方式進(jìn)行調(diào)查，主要內(nèi)容包括：吸煙、飲酒、高脂飲食、煙熏腌制食品、高膳食纖維飲食以及居住地周圍環(huán)境水源污染等項(xiàng)目。

1.3 基因多態(tài)性檢測 抽取研究對象靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，-20 ℃保存后轉(zhuǎn)-70 ℃低溫保存。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測3種基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性。分別是：MTHFR A1298C、NQO1-609C/T以及p53 Arg72Pro基因。PCR-RFLP多次檢測無法確定的結(jié)果，使用測序方法進(jìn)行基因型確定。各引物序列及用于測序引物見表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部資料用Microsoft Excel 軟件建立數(shù)據(jù)庫，對等位基因和基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)直腸癌和各個(gè)因素關(guān)系用相關(guān)分析檢驗(yàn)，采用多因素非條件logistic回歸方法篩選影響客家人結(jié)直腸癌發(fā)生的可疑危險(xiǎn)因素和保護(hù)性因素，計(jì)算比值比及95%CI，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 各引物序列及測序引物

2.1 結(jié)直腸癌患者危險(xiǎn)因素分析 單因素方差分析顯示，吸煙、飲酒、高脂飲食、煙熏腌制食品、高膳食纖維飲食以及居住地周圍環(huán)境水源污染與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。吸煙、飲酒、高脂飲食、煙熏腌制食品、環(huán)境水源污染與結(jié)直腸癌發(fā)生呈正相關(guān)(OR>1)，為結(jié)直腸癌的高危因素。而高膳食纖維飲食與結(jié)直腸癌發(fā)生呈負(fù)相關(guān)(OR=0.21)，為結(jié)直腸癌的保護(hù)因素。見表2。

2.2 MTHFR A1298C基因與結(jié)直腸癌 MTHFR A1298C基因多態(tài)性位點(diǎn)的4種基因型AC、CC、等位基因A、C在結(jié)直腸癌組中分布頻率分別為28.3%、6.7%、79.2%、20.8%，在健康對照組中分布頻率分別為1.7%、5.6%、83.5%、16.5%，兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但基因型AA在結(jié)直腸癌組的分布頻率為65.0%，在健康對照組的分布頻率為72.7%，可減少結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而突變基因型AC+CC在結(jié)直腸癌組的分布頻率為35.0%，在健康對照組的分布頻率為27.3%，可增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3 NQO1-609基因與結(jié)直腸癌 NQO1-609基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型CC，突變基因型CT、TT在結(jié)直腸癌組的分布頻率及健康對照組的分布頻率，見表4。相對于NQO1-609的基因型CC，突變基因型CT、TT可增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)，見表4。

2.4 p53Arg72Pro基因與結(jié)直腸癌 p53Arg72Pro基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型Pro/Arg、Pro/Pro在結(jié)直腸癌組中的分布頻率與在健康對照組中的分布頻率相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。但基因型Arg/Arg在結(jié)直腸癌組中的分布頻率高于健康對照組中的分布頻率，增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

3 討論

表2 結(jié)直腸癌組和健康對照組結(jié)直腸癌危險(xiǎn)因素單因素方差分析[例(%)]

表3 結(jié)直腸癌組與健康對照組MTHFR-A1298C多態(tài)性比較[例(%)]

表4 結(jié)直腸癌組與健康對照組NQO1-609多態(tài)性比較[例(%)]

表5 結(jié)直腸癌組與健康對照組p53Arg72Pro多態(tài)性比較[例(%)]

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其顯著的地域分布差異是結(jié)直腸癌流行病學(xué)的突出特征，也形成了界線分布明顯的高低發(fā)病區(qū)，這種特征提示環(huán)境因素在結(jié)直腸癌發(fā)生中可能起著主要作用。但在同樣的環(huán)境中，只有少數(shù)人最終發(fā)展成結(jié)直腸癌，提示遺傳因素在腫瘤的發(fā)病中也起著重要的作用。個(gè)體遺傳差異的物質(zhì)基礎(chǔ)之一就是易感基因多態(tài)性，而單核苷酸多態(tài)是基因多態(tài)性最主要的形式，它決定了種族和個(gè)體之間的差異。

環(huán)境因素一直被國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為是結(jié)直腸癌發(fā)病的重要影響因素。大量研究表明，長期或大量吸煙、飲酒會(huì)增加患結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)性，且存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[4]。酒本身無致癌性，但可作為致癌物的溶劑，促進(jìn)致癌物進(jìn)入黏膜，通過影響致癌物的吸收、代謝轉(zhuǎn)化及影響機(jī)體的營養(yǎng)平衡而參與致癌過程。吸煙也會(huì)增加患結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)性，交互作用的分析表明吸煙與飲酒之間存在聯(lián)合作用，比存在單一因素時(shí)危險(xiǎn)性增加[5]。高脂飲食可促進(jìn)膽汁酸的生物合成，產(chǎn)生高濃度的次級(jí)膽汁酸可造成DNA不可修復(fù)氧化損傷，進(jìn)而引起腸黏膜細(xì)胞增生，導(dǎo)致腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能改變[6-7]。煙熏食品經(jīng)高溫分解產(chǎn)生多環(huán)芳烴和雜環(huán)胺類等促癌、致癌物，腌制食品由于含有大量亞硝酸鹽，在體內(nèi)可經(jīng)I相代謝酶活化成為亞硝胺具有致癌性，而進(jìn)食新鮮蔬菜含有較豐富葉酸、維生素A、維生素C能降低結(jié)直腸癌發(fā)生[8]，可能與其含有多種抗氧化劑能防止DNA氧化損傷有關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)，居住地周圍環(huán)境污染、水源污染、室內(nèi)油煙污染等也可增加結(jié)直腸癌危險(xiǎn)性?？图胰司哂歇?dú)特的飲食習(xí)慣?？图也擞址Q“東江菜”，是廣東菜三個(gè)流派之一，菜肴風(fēng)味特點(diǎn)偏重，下油重，味偏咸，腌制食品突出。這種不科學(xué)飲食習(xí)慣可能會(huì)增加該人群結(jié)直腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝關(guān)鍵酶，能催化5，10-亞甲基四氫葉酸不可逆轉(zhuǎn)成5-甲基四氫葉酸，在葉酸代謝以及DNA甲基化和DNA合成修復(fù)的過程中發(fā)揮了重要作用。葉酸缺乏可能通過破壞DNA正常甲基化和基因組完整性而致癌[9]。MTHFR A1298C堿基突變使其編碼MTHFR蛋白活性和血漿葉酸水平明顯降低。對MTHFR基因多態(tài)性和人類腫瘤易感性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌、宮頸癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤等發(fā)生相關(guān)[10-11]。Keku等[12]在對白種人的研究，Kono等[13]和Changdy等[14]在對印度人的研究中均發(fā)現(xiàn)，MTHFR A1298C多態(tài)性和結(jié)直腸癌易感性相關(guān)，1298CC對結(jié)直腸癌具保護(hù)效應(yīng)。但另外一些研究則顯示突變基因型增加結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)。如El Awady等[15]在對埃及人的研究中發(fā)現(xiàn)，1298AC+CC基因型增加結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)。Naghibalhossaini等[16]在對伊朗人的研究中也認(rèn)為，A1298C突變增加結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果顯示，基因型AA在廣東省梅州客家人結(jié)直腸癌組的分布頻率為65.0%，在健康對照組的分布頻率為72.7%，可減少結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)；而突變基因型AC+CC在廣東省梅州客家人結(jié)直腸癌組的分布頻率為35.0%，在健康對照組的分布頻率為27.3%，可增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)。

醌氧化還原酶(NQO1)是一種重要的化學(xué)致癌物代謝酶，可催化醌雙電子還原的黃素酶，能對抗氧自由基作用產(chǎn)生抗氧化劑，在氧化應(yīng)激過程中有保護(hù)細(xì)胞的功能。NQO1第6外顯子的第609位核苷酸具有C/T單核苷酸多態(tài)性。該位點(diǎn)多態(tài)性可引起脯氨酸/絲氨酸改變，導(dǎo)致該酶活性下降，氧自由基生成增多，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，NQO1基因多態(tài)性與多種腫瘤(如白血病、肺癌、結(jié)直腸癌等)發(fā)生有關(guān)聯(lián)。Lafuente等[17]在對英國人的研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者NQO1突變基因型頻率明顯高于健康對照組，特別是伴Κ-ras基因突變的結(jié)直腸癌患者，NQO1突變基因型頻率達(dá)20%，是健康對照組的6倍。Harth等[18]在對高加索人的研究中發(fā)現(xiàn)，NQO1失活伴重度吸煙者結(jié)直腸癌發(fā)病率明顯增高。本研究結(jié)果顯示，NQO1-609基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型CC，突變基因型CT、TT在廣東省梅州客家人結(jié)直腸癌組的分布頻率分別為30.7%、32.0%、37.3%，在健康對照組的分布頻率分別為48.7%、32.7%、18.6%。相對于NQO1-609的基因型CC，突變基因型CT、TT可增加結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)。

p53基因是一種抑癌基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)等重要生物學(xué)功能，約50%以上人類腫瘤與該基因變化有關(guān)。p53基因的第72密碼子具有CGT/CCT的單核甘酸多態(tài)性，導(dǎo)致編碼氨基酸由精氨酸(Arg)被脯氨酸(Pro)取代，Arg72Pro多態(tài)性可能調(diào)控突變型p53的功能，而Pro型蛋白調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和修復(fù)基因損傷的功能較弱，影響p53蛋白生物學(xué)功能。研究顯示[19-20]，p53基因Arg72Pro多態(tài)性與多種惡性腫瘤相關(guān)。本研究結(jié)果顯示， p53Arg72Pro基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型Pro/Arg、Pro/Pro在廣東省梅州客家人結(jié)直腸癌組的分布頻率分別為47.0%、24.0%，在健康對照組的分布頻率分別為50.0%、28.7%，兩者相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但基因型Arg/Arg在結(jié)直腸癌組的分布頻率為29.0%，在健康對照組的分布頻率為21.3%，增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)。

結(jié)直腸癌病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展主要是遺傳因素及環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。結(jié)直腸癌發(fā)病具有明顯的地域特性，提示環(huán)境危險(xiǎn)因素在病因的重要作用，但遺傳因素作用同樣不容忽視。研究基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌遺傳性易感性的關(guān)系，有助于結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和高危個(gè)體的篩選，為開展有針對性的個(gè)體化預(yù)防提供依據(jù)。通過檢測與疾病相關(guān)的一組基因多態(tài)，結(jié)合一定的環(huán)境因素共同分析，才能確定高危個(gè)體，以期為腫瘤的早期診斷、預(yù)后評估及基因診治提供可行途徑。

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