羅文峰，程喜平，王繼輝，許德清

（1.廣東省佛山市中醫(yī)院 皮膚科，廣東 佛山 528000；2.廣州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510120；3.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院皮膚科，廣東 佛山 528000；4.廣東省中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院 皮膚科，廣東 廣州 510120）

慢性蕁麻疹是以風團和瘙癢為主要臨床癥狀的自身免疫性皮膚疾病，病機及發(fā)病機制尚未完全明確。免疫球蛋白E（immunoglobulins-E，IgE）介導的Ⅰ型變態(tài)反應以及Th1/Th2免疫應答紊亂被認為與慢性蕁麻疹的發(fā)病密切相關[1-2]。鹽酸非索非那是具有抗組胺活性的新型藥物，能夠拮抗組胺所介導的炎癥反應以及免疫應答紊亂；卡介菌多糖核酸是一類非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，具有抑制肥大細胞脫顆粒、與IgE抗體競爭性結合抗原的作用。已有研究報道，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸在慢性蕁麻疹的治療中展現(xiàn)出積極價值，但是關于該治療方案發(fā)揮治療作用的分子機制并不明確[3]。Toll樣受體（toll like receptor，TLR）是體內(nèi)重要的模式識別受體，參與免疫應答以及炎癥反應的調(diào)控。TLRs家族中的TLR2被證實與慢性蕁麻疹的發(fā)生有關[4-5]。在下列研究中，本研究分析奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸是否通過TLR2通路調(diào)節(jié)慢性蕁麻疹患者的免疫應答。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月-2016年11月在佛山市中醫(yī)院皮膚科確診為慢性蕁麻疹的78例患者作為研究對象。其中，男性31例，女性47例；年齡15～52歲。所有患者均符合慢性蕁麻疹的診斷標準，近1個月未使用過糖皮質(zhì)激素和免疫制劑，排除合并其他自身免疫相關性疾病、肝腎功能障礙或感染性疾病及對抗組胺藥物過敏。收住院告知研究事項，取得患者知情同意后給予奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療。

1.2 治療方法

患者入組后給予奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療，方法如下：奧洛他定5 mg、口服、2次/d；卡介菌多糖核酸注射液0.7 mg、肌內(nèi)注射、3次/周。治療4周后根據(jù)療效酌情減量或停藥。

1.3 外周血TLRs表達量的檢測

治療前和治療后2、4及6周時，采集患者的外周血，加入淋巴細胞分離液后離心，吸取中間懸浮的外周血單個核細胞，PBS洗滌、離心2遍后加入Trizol裂解液并分離細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應擴增，擴增的目的基因包括TLR2、TLR4、TLR7、TLR9，內(nèi)參基因為GAPDH，根據(jù)擴增曲線計算TLR2、TLR4、TLR7、TLR9的mRNA含量。

1.4 血清指標的檢測

治療前和治療后2、4及6周時，采集兩組患者的外周血，室溫靜置20 min后離心，分離血清后采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定IgE、補體C3、C4、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）的含量。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗；相關分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 治療前后外周血中TLRs的表達量

治療前和治療后2、4及6周時，外周血單個核細胞中TLR2 mRNA的含量隨治療時間趨勢遞減，各時間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；TLR4、TLR7及TLR9的mRNA含量在治療過程中無變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 治療前后血清中IgE、C3、C4含量比較

治療前和治療后2、4及6周時，血清中IgE的含量隨治療時間趨勢遞減，各時間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C3、C4 的含量隨治療時間趨勢遞增，各時間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 治療前后血清中Th1、Th2細胞因子含量比較

治療前和治療后2、4及6周時，血清中IFN-γ、IL-2的含量隨治療時間趨勢遞增，各時間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；IL-4、IL-10的含量隨治療時間趨勢遞減，各時間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 相關性分析結果

外周血單個核細胞中TLR2的mRNA表達量與血清中IgE、IL-4、IL-10的含量呈正相關，與血清中C3、C4、IFN-γ、IL-2的含量呈負相關。見表4。

表1 治療前后外周血中TLRs mRNA表達量比較 （n =78，±s）

注：1）與治療前比較，P ＜0.05；2）與治療后2周比較，P ＜0.05；3）與治療后4周比較，P ＜0.05

治療時間 TLR2 TLR4 TLR7 TLR9治療前 1.08±0.15 1.03±0.13 1.06±0.11 1.03±0.15治療后2周 0.77±0.061） 1.06±0.12 1.02±0.14 0.96±0.11治療后4周 0.52±0.072） 0.98±0.11 0.97±0.12 1.01±0.13治療后6周 0.34±0.043） 1.05±0.14 0.98±0.09 1.05±0.12 F值 14.822 0.251 0.226 0.184 P值 0.000 0.184 0.174 0.232

表2 治療前后血清中IgE、C3、C4含量的比較 （n =78，g/L，±s）

注：1）與治療前比較，P ＜0.05；2）與治療后2周比較，P ＜0.05；3）與治療后4周比較，P ＜0.05

組別 IgE C3 C4治療前 126.69±17.85 0.92±0.11 0.32±0.06治療后2周 56.52±7.521） 1.07±0.121） 0.41±0.061）治療后4周 33.15±3.642） 1.23±0.151） 0.47±0.071）治療后 6周 27.65±3.613） 1.42±0.161）2）3） 0.52±0.071）2）F值 22.812 8.582 7.962 P值 0.000 0.001 0.003

表3 治療前后血清中Th1、Th2細胞因子含量的比較 （n =78，ng/L，±s）

表3 治療前后血清中Th1、Th2細胞因子含量的比較 （n =78，ng/L，±s）

注：1）與治療前比較，P ＜0.05；2）與治療后2周比較，P ＜0.05；3）與治療后4周比較，P ＜0.05

組別 IFN-γ IL-2 IL-4 IL-10治療前 11.32±1.52 25.58±3.36 7.64±0.93 10.36±1.42治療后2周 16.67±2.031） 32.71±4.46 4.58±0.65 7.32±0.92治療后4周 22.26±3.142） 39.42±5.12 3.32±0.46 5.57±0.71治療后6周 32.18±4.853） 52.42±6.58 2.71±0.32 4.21±0.56 F值 18.382 12.283 22.182 11.028 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 TLR2 mRNA表達量與血清指標的相關性分析

3 討論

慢性蕁麻疹的發(fā)生與B淋巴細胞產(chǎn)生的IgE以及CD4+T細胞中Th2亞群產(chǎn)生的細胞因子IL-4、IL-10有關。IgE能夠介導I型變態(tài)反應，而IL-4和IL-10等細胞因子對IgE的產(chǎn)生具有正反饋效應。已有研究報道，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)IgE、IL-4、IL-10的產(chǎn)生增多，會造成補體C3和C4的不斷消耗、抑制Th1亞群的分化成熟及細胞因子的分泌[6-7]。奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸是目前臨床上治療慢性蕁麻疹的常用方案，前者是一類抗組胺藥物，能抑制組胺所介導的炎癥反應，抑制多種細胞因子的分泌和釋放[8]；后者是一類非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，能夠穩(wěn)定肥大細胞、與IgE競爭性結合肥大細胞上的抗原并抑制肥大細胞脫顆粒過程，同時也能調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群的平衡、糾正Th1/Th2的失衡狀態(tài)[9]。國內(nèi)安國芝[3]的研究證實，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療慢性蕁麻疹能夠取得確切療效。

在慢性蕁麻疹的病情發(fā)展變化過程中，TLRs家族中的TLR2、TLR4、TLR7、TLR9均被證實與患者體內(nèi)免疫應答和炎癥反應的紊亂有關，是造成慢性蕁麻疹發(fā)生以及病情發(fā)展的關鍵分子[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療能夠以時間依賴性的方式降低外周血單個核細胞中TLR2的mRNA含量，但是不會影響TLR4、TLR7、TLR9的mRNA含量。這說明奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療慢性蕁麻疹可能主要通過TLR2發(fā)揮作用。

IgE是介導慢性蕁麻疹患者體內(nèi)Ⅰ型變態(tài)反應的重要抗體，與肥大細胞表面FcεRI結合后能夠造成肥大細胞脫顆粒，進而分泌組胺等介質(zhì)并引起蕁麻疹的臨床癥狀[10-11]。在IgE介導Ⅰ型變態(tài)反應的過程中，補體C3和C4也發(fā)揮重要的協(xié)同作用并且會被不斷消耗[12]。相關臨床研究顯示，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)IgE的含量升高，而C3和C4的含量降低[13]。本研究結果顯示，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療能夠以時間依賴性的方式降低血清中IgE的含量且與外周血中TLR2的mRNA表達量呈正相關，以時間依賴性的方式增加C3和C4的含量且與外周血中TLR2的mRNA表達量呈負相關。這就說明奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療可能通過抑制TLR2的表達來減少IgE的分泌以及C3和C4的消耗。

在IgE介導Ⅰ型變態(tài)反應的過程中，Th1和Th2細胞對體液免疫應答過程以及自身抗體的分泌均具有調(diào)節(jié)作用。Th2細胞所分泌產(chǎn)生的IL-4、IL-10能夠介導體液免疫應答，對B細胞的分化成熟以及IgE的分泌具有促進作用；Th1細胞所分泌的IFN-γ、IL-2能夠介導細胞免疫，對Th2細胞的功能具有抑制作用。相關研究報道，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)Th1細胞的功能處于抑制狀態(tài)、Th2細胞的功能則增強。本研究結果顯示，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療能夠以時間依賴性的方式增加血清中IFN-γ、IL-2的含量且與外周血中TLR2的mRNA表達量呈負相關，以時間依賴性的方式降低IL-4、IL-10的含量且與外周血中TLR2的mRNA表達量呈正相關。表明奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療可能通過抑制TLR2的表達來調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫應答的平衡，抑制Th2免疫應答、增強Th1免疫應答。

綜上所述，奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸治療可通過TLR2通路調(diào)節(jié)慢性蕁麻疹患者體內(nèi)的IgE所介導的Ⅰ型免疫應答，同時也調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫平衡。

參 考 文 獻：

[1] KOLKHIR P, POGORELOV D, OLISOVA O, et al. Comorbidity and pathogenic links of chronic spontaneous urticaria and systemic lupus erythematosus-a systematic review[J]. Clin Exp Allergy,2016, 46(2): 275-287.

[2] FERRER M. Immunological events in chronic spontaneous urticaria[J]. Clin Transl Allergy, 2015, 25(5): 30.

[3] 安國芝, 何澤生, 孟昭影, 等. 奧洛他定聯(lián)合卡介菌多糖核酸對CIU患者血清總IgE及Th1/Th2的影響[J]. 中國皮膚性病學雜志,2014, 28(6): 575-578.

[4] 劉軍連, 徐冰心, 王曉菲, 等. 自身免疫性慢性蕁麻疹患者外周血單個核細胞TLR2的表達及意義[J]. 中國皮膚性病學雜志,2015, 29(7): 681-684.

[5] 王曉菲, 劉軍連, 宋淑軍, 等. 慢性蕁麻疹患者外周血單個核細胞Toll樣受體和DC-SIGN的檢測和分析[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2014, 30(7): 736-739.

[6] KOLKHIR P, BALAKIRSKI G, MERK H F, et al. Chronic spontaneous urticaria and internal parasites-a systematic review[J].Allergy, 2016, 71(3): 308-322.

[7] VESTERGAARD C, DELEURAN M. Chronic spontaneous urticaria: latest developments in aetiology, diagnosis and therapy[J]. Ther Adv Chronic Dis, 2015, 6(6): 304-313.

[8] TANIZAKI H, YAMAMOTO Y, NAKAMIZO S, et al. Comparison of the efficacy of olopatadine and fexofenadine in chronic idiopathic urticaria patients: a crossover study[J]. Pharmacology,2015, 95(1/2): 32-35.

[9] LIU W, WANG H, YU J, et al. Structure, chain conformation, and immunomodulatory activity of the polysaccharide purified from Bacillus Calmette Guerin formulation[J]. Carbohydr Polym, 2016,5(150): 149-158.

[10] SHIN Y S, SUH D H, YANG E M, et al. Serum specific IgE to thyroid peroxidase activates basophils in aspirin intolerant urticaria[J]. J Korean Med Sci, 2015, 30(6): 705-709.

[11] STERBA P M, HAMILTON R G, SAINI S S. Suppression of basophil Fc RI activation by serum from active chronic idiopathic/spontaneous urticaria (CIU/CSU) subjects[J]. J Invest Dermatol,2015, 135(5): 1454-1456.

[12] GUO A, ZHU W, ZHANG C, et al. Association of FCER1A genetic polymorphisms with risk for chronic spontaneous urticaria and efficacy of nonsedating H1-antihistamines in Chinese patients[J]. Arch Dermatol Res, 2015, 307(2): 183-190.

[13] AUYEUNG P, MITTAG D, HODGKIN P D, et al. Autoreactive T cells in chronic spontaneous urticaria target the IgE Fc receptor Iα subunit[J]. J Allergy Clin Immunol, 2016, 138(3): 761-768.