基于基因組學(xué)的天然產(chǎn)物研究

王 濤

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，日照 276826)

先導(dǎo)化合物的發(fā)掘與鑒定是新藥研發(fā)過(guò)程中一項(xiàng)耗時(shí)費(fèi)力、極具挑戰(zhàn)性的科研活動(dòng)。從歷史上看，來(lái)源于植物和微生物的天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)衍生物曾一度是新藥研發(fā)中先導(dǎo)化合物的主要來(lái)源，也是當(dāng)前臨床用藥的重要組成部分，特別是抗腫瘤和抗菌藥物。據(jù)統(tǒng)計(jì)(1981-2014年),臨床上使用的藥物有超過(guò)50%來(lái)源于天然產(chǎn)物。近幾年，仍有諸多有代表性的天然產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)衍生物)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段甚至被批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)，例如：Trabectedin,Halaven及Bryostatin等。究其原因，一方面是天然產(chǎn)物本身通常具有相對(duì)復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有大量的藥效團(tuán)結(jié)構(gòu)和高度的立體選擇性，導(dǎo)致了很多天然產(chǎn)物具有十分重要的生物活性；另一方面，研究表明:成功的藥物分子通常會(huì)具有類代謝產(chǎn)物性質(zhì)(metabolite-likeness)[1]。因此，作為次級(jí)代謝產(chǎn)物的天然化合物通常不僅具有目標(biāo)生物活性，而且極有可能是一種或者幾種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物，因而,更容易進(jìn)入胞內(nèi)環(huán)境發(fā)揮作用。以往，大多數(shù)的天然產(chǎn)物研究基本上都遵從一條自上而下的研究策略：基于目標(biāo)生物活性篩選化合物、產(chǎn)物提取及結(jié)構(gòu)鑒定。由于大部分的微生物(例如，海產(chǎn)動(dòng)物海兔，黑色軟海綿)不能在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)現(xiàn)分離和培養(yǎng)，因而傳統(tǒng)的自上而下的探索方法僅能接觸到微生物一小部分生物合成潛力，而一些原本可能十分有價(jià)值的藥用天然產(chǎn)物往往被忽略。這導(dǎo)致自20世紀(jì)以來(lái)，傳統(tǒng)的技術(shù)手段造成天然產(chǎn)物的再發(fā)現(xiàn)率急劇升高，難以發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物。

由于DNA測(cè)序成本的不斷降低及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使基因組學(xué)取得重大進(jìn)步，這也導(dǎo)致天然產(chǎn)物研究再次引起研究者的興趣。急劇膨脹的微生物基因組和宏基因組數(shù)據(jù)顯示自然界中存在著大量的生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGCs)，據(jù)估計(jì)這些基因簇能夠編碼合成的化合物將遠(yuǎn)超過(guò)現(xiàn)階段鑒定的化合物數(shù)量[2]。理論上通過(guò)DNA測(cè)序和基因組分析，幾乎可以鑒定出微生物中所有負(fù)責(zé)天然產(chǎn)物合成的BGCs，因此,也能獲得所有潛在的這些次級(jí)代謝產(chǎn)物信息。如何基于這些生物信息順利獲得這些潛在的化合物及如何高效生產(chǎn)目標(biāo)化合物使其滿足產(chǎn)業(yè)化的要求，將是未來(lái)天然產(chǎn)物研究的主要方向。本文重點(diǎn)闡述基于基因組的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的主要技術(shù)與概念，包括生物信息學(xué)指導(dǎo)的GGCs鑒定，沉默基因簇的激活以及組合生物合成生產(chǎn)新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物。

1 后基因組時(shí)代的藥物發(fā)現(xiàn)

隨著基因測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展、分子生物學(xué)及遺傳學(xué)等相關(guān)操作技術(shù)的成熟為新型天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)提供了新的研究思路與開(kāi)發(fā)途徑。不斷降低的測(cè)序成本，使得通過(guò)高通量基因組測(cè)序技術(shù)獲得不同物種的基因組序列信息變得越來(lái)越方便可行。通過(guò)對(duì)這些基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)、篩選并鑒定出潛在的、具有新穎結(jié)構(gòu)的活性化合物相關(guān)的“沉默”基因簇基因。因此，如何基于海量的基因組數(shù)據(jù)，挖掘發(fā)現(xiàn)新的活性天然產(chǎn)物已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

通過(guò)基因組學(xué)分析微生物代謝譜，定性和定量的分析機(jī)體在特定的時(shí)空條件下所有的代謝產(chǎn)物，不僅能夠直接的監(jiān)測(cè)基因的功能和機(jī)體的生理生化狀態(tài)，而且能夠有選擇性地優(yōu)化特定的生物合成途徑，進(jìn)而生產(chǎn)獲得有活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物?；诨蚪M學(xué)的藥物發(fā)現(xiàn)通常包含3個(gè)主要的步驟：1)BGCs的發(fā)現(xiàn)與鑒定；2)沉默基因簇的激活；3)組合生物合成生產(chǎn)目標(biāo)化合物。見(jiàn)圖1。

圖1 基于基因組學(xué)的藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程

2 BGCs的發(fā)現(xiàn)與鑒定

來(lái)源于微生物及植物的天然產(chǎn)物通常直接與其生物合成基因簇相關(guān)，通過(guò)編碼相應(yīng)的酶，調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、自身免疫及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。如何從海量的基因序列中優(yōu)先處理并鑒定出有價(jià)值的基因簇，是基于基因組學(xué)的藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中第一個(gè)關(guān)鍵步驟[3-4]?；蚪M挖掘(genome mining)技術(shù)可以通過(guò)分析孤兒基因簇(orphan BGCs)的基因序列確定其是否與新型的天然產(chǎn)物生產(chǎn)有關(guān)。目前，相關(guān)的一些生物信息學(xué)軟件已能夠在一定程度上滿足基因組挖掘的目的，例如：HMMER,GOLD,NORINE,SBSPKS,SEARCHPKS,NRPSpedictor,plantiSMASH。其中，AntiSMASH(antibiotics and secondary metabolite analysis shell)是在分析抗生素合成基因簇當(dāng)中使用最廣泛的一種生物信息學(xué)軟件之一[5]。它能夠進(jìn)行自動(dòng)的基因組鑒定，并能對(duì)生物合成基因簇進(jìn)行分析。其中3.0版本中完整的整合了最新版本的ClusterFinder算法，利用這種基于概率的算法,用戶能夠發(fā)現(xiàn)并識(shí)別一些未知類型的基因簇。這在通過(guò)基因組挖掘發(fā)現(xiàn)新型天然產(chǎn)物的研究中具有十分重要的應(yīng)用。隨著這些預(yù)測(cè)軟件/程序的不斷改善，基因挖掘也變得相對(duì)簡(jiǎn)單，研究者或許不再需要具備大量的經(jīng)驗(yàn)，但必須正視與注意這些分析軟件的應(yīng)用限制與不足。由于大多數(shù)的預(yù)測(cè)軟件都是基于現(xiàn)有的、有代表性的代謝途徑而開(kāi)發(fā)的，因此，它們可能更容易鑒定出一些比較成熟的BGCs(例如聚酮合酶復(fù)合物等等)，但是對(duì)一些不常見(jiàn)的代謝途徑，其鑒定潛在BGCs的能力可能就要大打折扣。雖然大多數(shù)預(yù)測(cè)軟件都不能很好地預(yù)測(cè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，也存在一定的應(yīng)用限制，但是基于計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)潛在的BGCs仍是指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的一個(gè)切實(shí)可行的出發(fā)點(diǎn)。

3 沉默基因簇的激活

天然產(chǎn)物通常是通過(guò)機(jī)體的次級(jí)代謝產(chǎn)生，這是一個(gè)途徑特異性、多效性，涉及全局性調(diào)控基因在內(nèi)的多層次嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，大量的BGCs在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下處于沉默或者弱表達(dá)狀態(tài)。因此，探索如何激活這些沉默的基因簇將對(duì)獲得潛在的活性天然產(chǎn)物具有十分重要的價(jià)值?；诓煌淖饔脵C(jī)制，基因簇激活的方法也有不同的分類，實(shí)際操作中主要有兩種不同的激活策略：物理化學(xué)方法和代謝工程改造方法。見(jiàn)圖2。

圖2 沉默基因簇激活的主要策略

3.1 物理化學(xué)法激活沉默基因簇

物理化學(xué)方法主要是改變微生物的培養(yǎng)條件，通過(guò)研究培養(yǎng)條件的變化刺激微生物做出某些應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生更多類型或更大數(shù)量的次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)應(yīng)對(duì)這一環(huán)境變化。One strain many compounds(OSMAC)法是實(shí)施這一策略的一種便捷有效的方法。該方法主要通過(guò)改變發(fā)酵過(guò)程中相關(guān)參數(shù)(改變培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、添加酶抑制劑及混菌發(fā)酵等)，激活不同功能基因簇,進(jìn)而改變其代謝途徑,產(chǎn)生新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。利用此方法，研究人員成功地發(fā)現(xiàn)了多種新結(jié)構(gòu)化合物，例如：桉烷型倍半萜類[6]，fusarielin[7]。但該方法在許多情況下并不能使微生物生產(chǎn)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并且該方法的使用具有一定的盲目性，各種成本較高，因此應(yīng)用范圍受到極大限制。針對(duì)這一限制，研究者通過(guò)將該方法與基因組掃描技術(shù)相結(jié)合，大大提高了發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)化合物和活性天然產(chǎn)物的概率。iChip(isolation chip)是OSMAC方法的一個(gè)重要擴(kuò)展，該技術(shù)的使用對(duì)于研究常規(guī)條件下無(wú)法培養(yǎng)的微生物具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

表觀遺傳修飾是通過(guò) DNA 甲基化、組蛋白共價(jià)修飾和非編碼 RNA 調(diào)控等手段干擾特定基因的正常表達(dá)，從而定向調(diào)控特定的代謝途徑。利用表觀遺傳修飾激活某些沉默的BGCs及其相關(guān)的代謝途徑、發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎和具有生物活性的化合物成為目前研究的熱點(diǎn)。在Aspergillusnidulans中，通過(guò)敲除表觀遺傳修飾酶(組蛋白脫乙?；讣敖M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶)能夠激活數(shù)個(gè)沉默基因簇，并且顯著的改變其代謝產(chǎn)物譜[8]。另外，化學(xué)干擾真菌的表觀遺傳同樣能夠改變機(jī)體的次級(jí)代謝，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。該方法雖然在激活沉默基因簇方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但是目前的技術(shù)手段對(duì)于表觀遺傳的修飾會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的代謝調(diào)控的全局改變[9]，因此會(huì)存在一定的盲目性，增加工作的難度。

3.2 代謝工程方法激活沉默基因簇

基于代謝工程策略激活沉默基因簇的方法是通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)沉默BGCs轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程起關(guān)鍵作用的調(diào)控基因，實(shí)現(xiàn)沉默基因簇的表達(dá)。隨著DNA測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步和蛋白組學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用該方法激活沉默基因簇具有目的性強(qiáng)的特點(diǎn)，是以后新藥發(fā)現(xiàn)與研發(fā)的主要方向。

3.2.1野生宿主沉默基因簇的激活 理論上，野生宿主細(xì)胞內(nèi)含有必要的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控因子(如前體化合物，路徑調(diào)控因子及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等)。因此，通過(guò)基因組編輯和基因工程技術(shù)，對(duì)野生宿主進(jìn)行一定的代謝工程改造，能在一定程度上激活沉默基因簇或者提高弱表達(dá)基因簇的表達(dá)量。一方面可以通過(guò)增加正調(diào)控因子(轉(zhuǎn)錄激活因子)的表達(dá)量激活沉默基因簇，生產(chǎn)新型的次級(jí)代謝產(chǎn)物(如新結(jié)構(gòu)51環(huán)糖基化大環(huán)內(nèi)酯[10])。另一方面，可以通過(guò)抑制負(fù)調(diào)控因子(如途徑特異性阻遏物)的表達(dá)量激活沉默基因簇，生產(chǎn)新型次級(jí)代謝產(chǎn)物[11]。需要注意的是，在一些生物合成途徑中沒(méi)有明顯的調(diào)控因子，此時(shí)通過(guò)全局調(diào)控基因的表達(dá)會(huì)是一個(gè)比較有幫助的方案。例如：通過(guò)定點(diǎn)突變RNA聚合酶或者核糖體蛋白能夠影響基因的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物[12]。

3.2.2異源宿主沉默基因簇的激活 對(duì)于一些無(wú)法培養(yǎng)的或者遺傳信息尚不明確的微生物，在異源宿主體內(nèi)操作特定的基因簇將是一條具有操作性的方法[13]。在選擇異源表達(dá)宿主時(shí)，針對(duì)特定的BGCs，必須充分考慮宿主是否含有必要的代謝前導(dǎo)物、催化酶以及恰當(dāng)?shù)恼{(diào)控系統(tǒng)。為了提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，通常需要對(duì)異源宿主進(jìn)行優(yōu)化。

在實(shí)際的操作中，在異源宿主中的表達(dá)BGCs之前，通常需要對(duì)其進(jìn)行重構(gòu)處理，例如：?jiǎn)?dòng)子替換,插入恰當(dāng)?shù)暮颂求w結(jié)合位點(diǎn)(RBS位點(diǎn))以及終止子的插入等。直接獲得目的基因簇，并在適宜的宿主中異源表達(dá)是最常見(jiàn)也是相對(duì)最容易的策略。例如在大腸桿菌體內(nèi)，通過(guò)RecET介導(dǎo)的線性重組可以將巨大合成酶(megasynthetase)插入表達(dá)載體進(jìn)而成功表達(dá)[14]。結(jié)果表明，即使是超過(guò)50kb的基因簇也能夠成功的構(gòu)建表達(dá)載體并實(shí)現(xiàn)高效異源表達(dá)，獲得目標(biāo)表達(dá)產(chǎn)物。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前在基因重組領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)工具，利用RNA介導(dǎo)的Cas9核酸酶，通過(guò)Gibson 組裝[15]或者TAR(transformation-associated recombination)[16]可以更加方便地直接克隆大片段基因簇(>100kb)。見(jiàn)圖3。

圖3 一種基因簇重構(gòu)激活沉默基因簇激活的方法示意圖

4 組合生物合成生產(chǎn)目標(biāo)化合物

組合生物合成基于酶底物多功能性(substrate promiscuity)，通過(guò)利用工程改造的催化酶或者代謝途徑生產(chǎn)新型的‘非天然’天然化合物。因此，如何在異源宿主細(xì)胞內(nèi)高效地表達(dá)組合生物合成途徑將對(duì)提高化合物的產(chǎn)量具有重要的意義,能夠最終實(shí)現(xiàn)降低藥物研發(fā)成本的目的。由于聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)和非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs)內(nèi)在的模塊化屬性及其催化產(chǎn)物的可預(yù)測(cè)性，使其成為這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)成功的應(yīng)用組合生物學(xué)生產(chǎn)聚酮類化合物、非核糖體肽以及皂苷的生物合成[17-20]。

組合生物合成的實(shí)施主要包括3種策略，即:1)基于前體化合物的組合生物合成;2)基于酶的修飾;3)基于代謝通路的重組。

4.1 基于前體化合物的生物合成

基于前體化合物的組合生物合成，不僅能夠成功應(yīng)用于PKSs及NRPSs復(fù)合物的研究，而且對(duì)于PKS/NRPS 雜合的酶復(fù)合物也具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值(見(jiàn)圖4)。目前，大量的具有重要研究?jī)r(jià)值的酶未被結(jié)構(gòu)鑒定，這往往給后續(xù)研究造成比較大的障礙。而基于前體化合物的組合生物合成，能夠有效解決這一難題，只要知道其前體化合物即可。

注：1.來(lái)源于鏈霉菌的NRPS腺苷酰化蛋白 CytC1 2.惡唑霉素酮基合成酶區(qū)域 3.III 型PKS ArsC

圖4 幾種典型的PKS蛋白酶

在天然產(chǎn)物組裝過(guò)程中，單體的多樣性很大程度上決定了其結(jié)構(gòu)的多樣性?；谇绑w化合物的組合生物合成利用天然產(chǎn)物生物合成過(guò)程中酶底物的多樣性，通過(guò)吸收不同的單體從而催化合成不同的天然產(chǎn)物類似物。模塊化I類聚酮合酶(mPKSs)包含連續(xù)的催化模塊，而每一模塊具有不同的催化區(qū)域能夠完成C鏈延伸的一個(gè)循環(huán)。例如，在Streptomycescinnamonensis體內(nèi)，聚醚抗生素-monensin就是通過(guò)mPKS的作用生物合成。脂?；D(zhuǎn)移酶區(qū)域(AT 區(qū)域)是monensin合成PKS復(fù)合物中的第5個(gè)模塊，能夠吸收非天然丙二酸衍生物作為單體，合成新的monensin前體衍生物。基于AT區(qū)域的計(jì)算機(jī)模型，Bravo-Rodriguez等預(yù)測(cè)該酶的AT活性區(qū)域能夠吸收體積較大的丙炔基基團(tuán)作為底物單體，通過(guò)添加人工合成化合物-propargyl-malonyl-N-acetyl-cysteamine，經(jīng)過(guò)StreptomycescinnamonensisA495發(fā)酵生成了丙炔基-monensin前體化合物[18]。與多模塊PKSs不同，III型PKSs結(jié)構(gòu)上比較簡(jiǎn)單，僅含有一個(gè)活性區(qū)域重復(fù)催化聚酮化合物合成的啟動(dòng)、延伸及環(huán)化反應(yīng)。由于其顯著的底物耐受能力，III型PKSs復(fù)合物為組合生物合成新型的“非天然”天然產(chǎn)物提供了一個(gè)極好的平臺(tái)。來(lái)自于原始石松Huperziaserrata中的HsPKS1能夠接受不同的起始單元生產(chǎn)大量的芳香族丁烯酮化合物。出乎意料的是，HsPKS1也能接受大型的起始單元(4-methoxycinnamoyl-coenzyme A(CoA)，N-methylanthraniloyl-CoA),通過(guò)添加這些單體成功獲得了 4-methoxy-2′,4′,6′-trihydroxychalcone 及1,3-dihydroxy-N-methylacridone。

除了mPKSs，NRPSs能夠組裝大量的多肽化合物天然產(chǎn)物，包括：抗生素(actinomycin,daptomycin),免疫抑制劑(cyclosporine A),及抗腫瘤藥物(bleomycin)等。尿苷肽類抗生素是通過(guò)NRPSs合成的一類具有較好抗菌效果的肽類抗生素，但其合成酶的底物特異性比較差，能夠催化合成新的sansanmycin衍生物[21]。Zhang等[22]鑒定出了一條9酶 ‘組裝線’，能夠生物合成pacidamycin。由于該酶復(fù)合物中的PacI和A區(qū)域的底物特異性差，從而生產(chǎn)出其它的9種pacidamycin結(jié)構(gòu)類似物。見(jiàn)圖5。

注：AT，?；D(zhuǎn)移酶;ACP，?；d體蛋白 KS，酮基合成酶;KR，酮基還原酶 DH，脫水酶

圖5 典型的PKS復(fù)合物參與催化反應(yīng)示意圖

4.2 基于酶的修飾

在聚酮化合物生物合成過(guò)程中，I類PKS(mPKSs)中每一模塊催化一步特定的反應(yīng)，然后將成熟的產(chǎn)物傳遞給下一模塊，這一特性使得通過(guò)“排列與組合”這些酶復(fù)合物來(lái)設(shè)計(jì)并合成新產(chǎn)物成為可能。

通過(guò)對(duì)mPKSs中特定的酶進(jìn)行修飾(包括整個(gè)功能域、模塊或者亞基的替換)，進(jìn)而使其所催化的底物發(fā)生變化產(chǎn)生新化合物結(jié)構(gòu)，已經(jīng)成為組合生物合成方法的常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段。例如，利用雷帕霉素合成途徑中的乙酰轉(zhuǎn)移酶區(qū)域替換紅霉素合成系統(tǒng)中的乙酰轉(zhuǎn)移酶區(qū)域，能夠獲得61種6-deoxyerythronolide B(6-DEB)類似物，其中包含多種新結(jié)構(gòu)化合物[23]。研究發(fā)現(xiàn)：對(duì)于NRPSs，功能域及模塊替換同樣能夠達(dá)成相似的目的[24]，研究者通過(guò)敲除A54145 NRPSs中的lptI甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)獲得多種新結(jié)構(gòu)化合物。與mPKSs不同，I型PKSs(iPKSs)反復(fù)利用一套催化區(qū)域合成特定產(chǎn)物。通過(guò)理性功能域重構(gòu)，不僅能夠產(chǎn)生新型的“非天然”天然產(chǎn)物，而且有助于深入研究該類酶的催化機(jī)理。例如，用來(lái)自于StcA的SAT功能域替換AfoE中的 ACP?；D(zhuǎn)移酶(SAT)能夠生產(chǎn)一種新型的非天然聚酮類產(chǎn)物。

作為酶工程的經(jīng)典方法，定點(diǎn)突變與定向進(jìn)化技術(shù)同樣可以用在組合生物學(xué)中。這些方法的使用不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定酶結(jié)構(gòu)與動(dòng)能的改造，而且能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)其本身的催化活性影響最小的目標(biāo)。例如，通過(guò)定點(diǎn)突變使特定的還原酶區(qū)域失活，能夠產(chǎn)生22種premonensin結(jié)構(gòu)衍生物[25]。為了改變NRPS AT區(qū)域的底物特異性，通過(guò)在AT區(qū)域種引入K278Q單突變，能夠?qū)⑵涞孜锾禺愋詮墓劝彼嶙兂晒劝滨０?，產(chǎn)生含谷氨酰胺的CDA結(jié)構(gòu)類似物[26]。與定點(diǎn)突變相比，定向進(jìn)化能在引起功能域底物特異性強(qiáng)烈變化的同時(shí)，最大限度地減少酶活的損失。Zhang等[27]通過(guò)酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)顯著地改變了bacillibactin NRPS 復(fù)合物中DhbE AT區(qū)域底物的特異性，使其識(shí)別非天然底物的特異性提高了200多倍，并且合成了非天然芳香族單體。

4.3 基于代謝通路的重組

分子生物學(xué)和合成生物學(xué)的不斷進(jìn)步使得在遺傳代謝清晰的宿主細(xì)胞中異源表達(dá)不同物種的生物合成基因簇成為一種切實(shí)可行的實(shí)驗(yàn)操作。自1985年以來(lái)，‘雜交’代謝途徑便被廣泛地應(yīng)用在新型天然產(chǎn)物的生物合成中。例如三萜皂苷，就已經(jīng)被成功的利用組合生物合成的方法異源合成。首先在酵母細(xì)胞中分別異源表達(dá)β-香樹(shù)精合成酶、細(xì)胞色素 P450 還原酶、 β-香樹(shù)精氧化酶CYP93E2 和 CYP72A61v2以及β-香樹(shù)精合成酶、細(xì)胞色素 P450 還原酶、 β-香樹(shù)精氧化酶CYP716A12 和CYP72A68v2，通過(guò)這些酶的共同作用分別成功合成大豆皂醇 B 和絲石竹酸。并且后一種方法中得到的工程菌能夠生產(chǎn)非天然三萜類化合物。

糖類化合物通常對(duì)藥物-靶點(diǎn)的相互作用起著重要的作用，糖基化過(guò)程會(huì)對(duì)藥物溶解性和生物活性產(chǎn)生顯著影響。因此，化合物的糖基化給新藥發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)新的方向?；谔巧锖铣少|(zhì)粒(“sugar biosynthesis plasmids”)[28]的方法，能夠方便地獲取新型的糖-修飾藥物，特別是針對(duì)那些具有良好抗腫瘤活性卻存在嚴(yán)重的細(xì)胞毒性化合物，例如普卡霉素。Núez等[29]在工程菌S.argillaceusM3W1中表達(dá)糖基化NDP-d-digitoxose合成質(zhì)粒，通過(guò)改變糖分子輪廓或者同時(shí)改變其分子輪廓和3-側(cè)鏈，獲得七種新結(jié)構(gòu)普卡霉素結(jié)構(gòu)類似物。其中的一種(demycarosyl-3D-β-ddigitoxosyl-mithramycin SK)表現(xiàn)出高效的抗腫瘤活性，而其細(xì)胞毒性卻比mithramycin低很多。Han 等[30]開(kāi)發(fā)了一種高效的、基于Streptomycesvenezuelae的系統(tǒng)。研究者首先在宿主S.venezuelae中敲除苦霉素的生物合成基因簇，然后在工程菌細(xì)胞中通過(guò)異源表達(dá)不同的基因組合，依次實(shí)現(xiàn)脫氧糖的激活、ε-羅多新醌配基的轉(zhuǎn)化以及糖基化后修飾過(guò)程，從而將阿霉素的ε-羅多新醌配基轉(zhuǎn)化成糖基化阿霉素類似物。

5 小結(jié)與展望

天然產(chǎn)物目錄(the Dictionary of Natural Products)已經(jīng)收錄了大約20萬(wàn)種植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中包括大約17萬(wàn)種獨(dú)特結(jié)構(gòu)。ClinicalTrials.gov數(shù)據(jù)庫(kù)中，大約15%的藥物來(lái)源于植物。雖然植物化學(xué)在藥物發(fā)現(xiàn)中取得了巨大的成功，但是面對(duì)著如此巨大的植物種類，研究者們確信在現(xiàn)代藥物研發(fā)中仍有許多資源值得深入開(kāi)發(fā)。因此，如何系統(tǒng)、全面、有針對(duì)性地對(duì)來(lái)源于植物的天然產(chǎn)物進(jìn)行深入的研究，是在后基因組時(shí)代急需解決的一個(gè)科學(xué)問(wèn)題。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物是新藥發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)重要的來(lái)源，其生物多樣性要遠(yuǎn)超過(guò)真核生物的代謝產(chǎn)物。然而，由于大量的微生物不能在實(shí)驗(yàn)室成功培養(yǎng)，導(dǎo)致僅有不到1%的微生物得到充分的研究。一方面，雖然海洋微生物中物種豐富，但其中相當(dāng)多的物種在實(shí)驗(yàn)室中無(wú)法正常培養(yǎng)，因而，是新藥研發(fā)過(guò)程中亟待開(kāi)發(fā)的領(lǐng)域，具有重要的研究?jī)r(jià)值。另一方面，海洋特殊生態(tài)系統(tǒng)決定了海洋生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性，必定存在著大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、生物活性多樣、作用機(jī)制獨(dú)特的天然化合物。因而在后續(xù)的新藥研發(fā)過(guò)程中，必須對(duì)海洋生物資源更加重視，基于高通量測(cè)序獲得的DNA序列大數(shù)據(jù)，更加有針對(duì)性地進(jìn)行開(kāi)發(fā)，發(fā)現(xiàn)重要先導(dǎo)藥物。

以基因組挖掘?yàn)閷?dǎo)向，深入研究復(fù)雜天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)制、調(diào)控機(jī)制、關(guān)鍵酶反應(yīng)機(jī)制等是加快天然產(chǎn)物研究的一個(gè)必需步驟。通過(guò)在微生物體內(nèi)針對(duì)代謝途徑進(jìn)行遺傳操作，不僅能夠獲得更多新結(jié)構(gòu)、高活性的化合物，還能發(fā)現(xiàn)不同種類化合物的生物合成途徑，這將為新藥研發(fā)提供嶄新的途徑。在新藥發(fā)現(xiàn)和研發(fā)領(lǐng)域，組合生物合成是以天然產(chǎn)物的生物合成及代謝為基礎(chǔ)，從分子水平對(duì)天然產(chǎn)物的生物合成途徑進(jìn)行合理化的遺傳修飾和重組，建立結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物類似物庫(kù)可以從中開(kāi)發(fā)出更具有臨床應(yīng)用價(jià)值的藥物。

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