曹 凡 高貴田,2 -,2 雷玉山 - 杜瑩琳 - 朱 丹

徐雅芬1XU Ya-fen1 張曉萍1ZHANG Xiao-ping1 李朝政1LI Chao-zheng1 張 鑫1ZHANG Xin1

獼猴桃(Actinidiachinensis)是“水果之王”“維C之冠”[1-2]。全球共有30多個(gè)國(guó)家栽培種植，其中中國(guó)獼猴桃栽培面積及產(chǎn)量最大，分別占全世界的53%和38%[3]。中國(guó)獼猴桃的主要產(chǎn)區(qū)分布在陜西、四川、安徽等地。絕大多數(shù)獼猴桃品種為功能性雌雄異株類型，人工授粉對(duì)獼猴桃果實(shí)大小及商品性、果肉顏色、產(chǎn)量等具有決定作用[4-6]。近年來(lái)，獼猴桃產(chǎn)區(qū)爆發(fā)毀滅性的細(xì)菌性潰瘍病，其病原菌為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)[6-8]。該病原菌致病性強(qiáng)、危害重、發(fā)病速度快、寄主范圍廣[9]，一旦感染發(fā)病無(wú)有效藥物防治，只有挖樹(shù)毀園，嚴(yán)重威脅獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在獼猴桃花粉傳播Psa的研究方面，Gallelli等[10]通過(guò)分子檢測(cè)水平發(fā)現(xiàn)意大利的獼猴桃花粉中存在Psa；Stefani等[11]也從花粉中檢測(cè)到Psa，并且認(rèn)為花粉是導(dǎo)致獼猴桃潰瘍病傳播的重要原因；Vanneste等[12]通過(guò)檢測(cè)認(rèn)為新西蘭目前大面積流行的PSA-V(強(qiáng)致病力菌株)病原菌是由于進(jìn)口帶菌花粉引起；Pattemore等[13]研究發(fā)現(xiàn)蜜蜂在Psa的傳播過(guò)程中也起了較重要的作用。新西蘭學(xué)者Everett等[14]通過(guò)熱處理方式殺滅花粉中的Psa，該方法在菌懸液濃度為107CFU/mL，55 ℃ 處理3.1 min，對(duì)Psa的殺滅率可達(dá)90%，但花粉生活力下降可達(dá)50%，對(duì)花粉生活力影響較大。目前中國(guó)在殺滅花粉中Psa方面還未有報(bào)道。

目前，對(duì)Psa的田間防治多采用化學(xué)試劑對(duì)樹(shù)干、枝條、土壤等部位進(jìn)行預(yù)防，噻霉酮、可殺得等農(nóng)藥對(duì)Psa的殺滅也取得較好的效果[15-17]。二氧化氯(ClO2)被世界衛(wèi)生組織和世界糧食組織列為A1級(jí)安全高效的消毒劑，殺菌速度快、副產(chǎn)物少、效率高，非常適合作果蔬表面的殺菌消毒劑[18-21]。ClO2具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和氧化能力，對(duì)病毒、真菌、芽孢等具有殺滅作用[22-24]，對(duì)獼猴桃表面微生物灰霉[25]、青霉[26]、鏈格孢[27]等多種微生物具有較強(qiáng)的殺菌作用。

本研究選用ClO2、噻霉酮、可殺得三千3種藥劑來(lái)殺滅獼猴桃花粉中的Psa，并研究3種藥劑對(duì)獼猴桃花粉生活力及獼猴桃果實(shí)產(chǎn)量、商品性的影響。建立既能殺死花粉中Psa又能保持花粉活力的消毒方法，為防止獼猴桃花粉傳播Psa提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)：西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院黃麗麗教授惠贈(zèng)；

獼猴桃花粉：陜西佰瑞獼猴桃研究院有限公司；

ClO2緩釋劑：有效緩釋劑8%，天津市張大科技發(fā)展有限公司；

噻霉酮：陜西西大華特科技實(shí)業(yè)有限公司；

可殺得三千：上海杜邦農(nóng)化有限公司；

蛋白胨：分析純，北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

硫代硫酸鈉、NaOH、2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-30KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

恒溫振蕩器：THZ-C型，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)器械設(shè)備廠；

生物顯微鏡：麥克奧迪BA200型，杭州量子檢測(cè)儀器有限公司。

1.2 Psa的培養(yǎng)

將Psa甘油菌接種在固體培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱24 ℃ 培養(yǎng)3 d，挑取單菌落接種在已滅菌的液體培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩器中過(guò)夜培養(yǎng)12 h，菌懸液濃度為104CFU/mL。

1.3 3種藥劑對(duì)獼猴桃花粉中Psa殺滅效果研究

將培養(yǎng)好的菌懸液均勻噴濕在獼猴桃花粉上，自然晾干。準(zhǔn)確稱取被Psa污染的花粉0.1 g于100 mL King’s B 液體培養(yǎng)基中(2.00 g蛋白胨、0.15 g MgSO4·7H2O、0.15 g K2HPO4、1 mL甘油)，24 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)8～12 h，使菌懸液濃度為104CFU/mL。配置ClO2溶液濃度梯度為1.25，12.50，25.00 mg/L；噻霉酮溶液濃度梯度為125.0，312.5，625.0 μL/L；可殺得三千溶液濃度為12.50，31.25，62.50 mg/L。分別吸取菌懸液1 mL對(duì)應(yīng)加入4 mL不同濃度的ClO2、噻霉酮、可殺得三千溶液于10 mL離心管，充分混勻，使ClO2溶液最終濃度分別達(dá)到1，10，20 mg/L；噻霉酮溶液最終濃度分別達(dá)到100，250，500 μL/L；可殺得三千溶液最終濃度分別達(dá)到10，25，50 mg/L。作用時(shí)間梯度為15，30，45，60 min 后，加入0.5 mL中和劑(5 g硫代硫酸鈉晶體與20 mL 吐溫80加熱溶于1 000 mL磷酸緩沖液中)，中和10 min，用無(wú)菌水代替ClO2溶液進(jìn)行空白對(duì)照。吸取最終樣液100 μL進(jìn)行涂布，于24 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，菌落計(jì)數(shù)法按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

c——?dú)缏剩?；

m1——對(duì)照組菌落數(shù)；

m2——試驗(yàn)組菌落數(shù)。

1.4 3種藥劑對(duì)花粉生活力影響

準(zhǔn)確稱取0.1 g花粉，分別加入1 mL的ClO2溶液濃度為1，10，20 mg/L；噻霉酮溶液濃度為100，250，500 μL/L；可殺得三千溶液濃度為1，5，10 mg/L于10 mL離心管中，充分混勻，分別作用15，30，45 min后，加入0.5 mL中和劑，中和10 min，用無(wú)菌水代替ClO2溶液進(jìn)行空白對(duì)照。以氯化三苯基四氯唑(TTC)染色法進(jìn)行花粉活力的檢測(cè)[28]，取1滴最終樣液于載玻片上，加1滴TTC染色劑染色后制成切片，在35 ℃烘箱中放置15 min，于光學(xué)顯微鏡下觀察，顯示紅色即為有生活力的花粉。每個(gè)處理觀察3個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片觀察3個(gè)視野，按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

c——花粉生活力，%；

m1——有生活力花粉數(shù)；

m2——總花粉數(shù)。

1.5 花粉消毒

花粉消毒處理液體授粉花粉溶液根據(jù)文獻(xiàn)[29]修改如下：對(duì)照組0.5 g 花粉、0.1 g 硼砂、0.3 g 蔗糖、50 μL 柔水通、0.5 g 硫代硫酸鈉、2.0 mL 吐溫80、100 mL磷酸緩沖液。處理組根據(jù)對(duì)Psa的殺滅率及花粉生活力的試驗(yàn)結(jié)果，將ClO2、噻霉酮、可殺得三千分別加入花粉溶液(0.5 g 花粉、0.1 g 硼砂、0.3 g 蔗糖、50 μL 柔水通、100 mL磷酸緩沖液)中，使終濃度分別為10，500，10 mg/L，處理45，30，15 min后加入中和劑(0.5 g 硫代硫酸鈉、2.0 mL吐溫80)?；ǚ廴芤盒璎F(xiàn)配現(xiàn)用，超過(guò)2 h花粉逐漸失去活力，影響授粉效果。

1.6 授粉

以陜西省周至縣九峰鄉(xiāng)5年生獼猴桃種植園為試驗(yàn)田，選取健康、無(wú)病害、樹(shù)勢(shì)相近的“海沃德”獼猴桃果樹(shù)16棵，4棵樹(shù)為一試驗(yàn)組，根據(jù)對(duì)Psa的殺滅率及花粉生活力的試驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)置為ClO2處理組：ClO2溶液濃度10 mg/L，處理時(shí)間45 min；噻霉酮處理組：噻霉酮溶液濃度500 μL/L，處理時(shí)間30 min；可殺得三千處理組：可殺得三千溶液10 mg/L，處理時(shí)間15 min；對(duì)照組：不做任何處理。授粉前，將所有雌花在大蕾期進(jìn)行套袋，防止蜜蜂授粉，盛花期解開(kāi)套袋并進(jìn)行授粉，授粉后立即再套袋，防止蜜蜂進(jìn)行二次授粉。待獼猴桃花瓣自然脫落，解開(kāi)套袋。進(jìn)行人工授粉時(shí)，以清晨授粉為宜，以確保能夠有充分的授粉率。

1.7 果實(shí)座果率、產(chǎn)量、種子數(shù)的統(tǒng)計(jì)

授粉結(jié)束1個(gè)月后，調(diào)查各樹(shù)座果率。10月中旬采摘果實(shí)，調(diào)查獼猴桃產(chǎn)量、單果重、果實(shí)種子數(shù)。以每4棵樹(shù)為一個(gè)試驗(yàn)組，根據(jù)每棵樹(shù)的總產(chǎn)量和果實(shí)個(gè)數(shù)計(jì)算每棵樹(shù)果實(shí)單果重。每棵樹(shù)分別選取大、中、小3個(gè)大小不同的獼猴桃，于室溫下放至變軟，取1/4，去皮、芯，置于紗布中揉搓，將果渣倒入水中搖勻靜置5 min，棄渣取出種子。按式(3)計(jì)算座果率。

(3)

式中：

c——座果率，%；

m1——座果數(shù)；

m2——授粉花朵數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種藥劑對(duì)花粉中Psa的殺滅率

由表1可知，隨著處理濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)Psa殺滅作用逐漸增大。當(dāng)ClO2的濃度為10 mg/L，處理45 min 時(shí)，對(duì)Psa的殺滅率達(dá)到99%以上，ClO2的濃度為20 mg/L，處理45 min時(shí)，對(duì)Psa的殺滅率達(dá)到100%；噻霉酮的濃度為500 μL/L，處理30 min，對(duì)Psa的殺滅率達(dá)到99%以上，當(dāng)處理時(shí)間為45 min時(shí)，殺滅率可達(dá)100%；可殺得三千的處理濃度為10 mg/L，時(shí)間為15 min時(shí)，殺滅率為99%以上，當(dāng)處理時(shí)間為45 min時(shí)，殺滅率可高達(dá)100%。

2.2 3種藥劑對(duì)花粉生活力的影響

花粉生活力是判斷花粉是否具有授精能力的指標(biāo)，環(huán)境溫度、濕度對(duì)花粉生活力都有較大的影響[30]。由表2可知，用噻霉酮和可殺得三千處理花粉后，花粉的生活力隨著藥劑濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；使用ClO2溶液處理花粉后，同一濃度，處理前30 min，花粉生活力逐漸下降，但處理后期，花粉生活力呈上升趨勢(shì)。ClO2屬于弱酸類化合物，與孢粉素不溶，花粉的外壁完整，對(duì)花粉生活力影響較小?？蓺⒌萌菬o(wú)機(jī)銅制劑，有效成分是氫氧化銅，屬于堿制劑，能溶解孢粉素，破壞花粉外壁，降低花粉生活力。

通過(guò)3種藥劑對(duì)Psa的殺滅作用和花粉生活力的研究，選擇殺滅作用高且對(duì)花粉生活力影響小的藥劑濃度和作用時(shí)間。因此本研究選擇ClO2溶液濃度10 mg/L，時(shí)間45 min，噻霉酮溶液濃度500 μL/L，時(shí)間30 min；可殺得三千溶液濃度10 mg/L，時(shí)間15 min。

2.3 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃產(chǎn)量、種子數(shù)的影響

2.3.1 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃座果率的影響 獼猴桃花粉的生活力直接影響果實(shí)的座果率，花粉生活力越大，座果率越高。授粉前，對(duì)照組、ClO2溶液、噻霉酮和可殺得三千處理組花朵數(shù)分別為63.47，71.45，78.47，81.85個(gè)，授粉1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)座果數(shù)分別為53.00，52.50，52.75，57.75個(gè)，座果率分別為83.5%，73.48%，67.22%，70.56%，較對(duì)照組分別下降12.0%，15.5%，19.5%，各處理組均與對(duì)照組有極顯著性差異(P<0.01)，但ClO2處理組對(duì)座果率影響較小，見(jiàn)圖1。因此，在生產(chǎn)中，應(yīng)盡量選擇對(duì)座果率影響較小的試劑處理花粉。

表1 3種藥劑作用濃度和時(shí)間對(duì)花粉中Psa殺滅效果的影響?Table 1 Efficacy of three kinds of medicament in killing Psa of pollen for different periods of concentration and time (n=3)

? 試驗(yàn)溫度是25 ℃；不同小寫(xiě)字母表示縱向P≤5%差異顯著性，不同大寫(xiě)字母表示橫向P≤5%差異顯著性。

表2 3種藥劑作用濃度和時(shí)間對(duì)花粉生活力的影響?Table 2 Efficacy of three kinds of medicament in killing Psa for different periods of concentration and time (n=3)

? 不同小寫(xiě)字母表示縱向P≤5%差異顯著性，不同大寫(xiě)字母表示橫向P≤5%差異顯著性。

2.3.2 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃總產(chǎn)量的影響 由圖2可知，對(duì)照組、ClO2溶液、噻霉酮和可殺得三千處理組獼猴桃果實(shí)的總產(chǎn)量分別為4 455.0，4 205.0，4 078.5，3 955.0 g，3種藥劑處理花粉后總產(chǎn)量都有下降，以可殺得三千處理組下降最多，較對(duì)照組下降11.2%，差異顯著(P<0.05)；ClO2處理組和噻霉酮處理組較對(duì)照組分別下降5.6%和8.4%，均無(wú)顯著性差異，以ClO2處理組較好。

2.3.3 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃單果重的影響 由圖3可知，對(duì)照組、ClO2溶液、噻霉酮和可殺得三千處理組獼猴桃果實(shí)的單果重分別為84.06，79.02，75.65，68.48 g，3種藥劑處理花粉后果實(shí)的單果重都有降低，以可殺得三千處理組下降最多，較對(duì)照組下降18.5%，差異顯著(P<0.05)；ClO2處理組和噻霉酮處理分別下降6%和10%，均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明ClO2處理組和噻霉酮處理組對(duì)獼猴桃單果重的影響不大，以ClO2處理組較好。

圖1 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃座果率的影響Figure 1 Effects of three kinds of medicament on setting rate of kiwifruit (n=3)

圖2 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃總產(chǎn)量的影響Figure 2 Effects of three kinds of medicament on output of kiwifruit (n=3)

2.3.4 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃種子數(shù)的影響 授粉效果影響果實(shí)種子數(shù)量，從而影響果實(shí)大小。一般種子越多，果實(shí)越大，風(fēng)味越好[31-32]。由圖4可知，對(duì)照組、ClO2溶液、噻霉酮和可殺得三千處理組獼猴桃果實(shí)種子數(shù)分別為791.75，781.50，479.00，480.25個(gè)，其中可殺得三千處理組和噻霉酮處理組的果實(shí)種子數(shù)較對(duì)照組下降可達(dá)35%以上，差異極顯著(P<0.01)；ClO2處理組的種子數(shù)僅下降1.2%，無(wú)顯著性差異，表明ClO2處理組對(duì)種子數(shù)影響較小。結(jié)果與郭曉成[33]發(fā)現(xiàn)的獼猴桃果實(shí)中種子數(shù)量與果實(shí)大小呈正相關(guān)結(jié)果一致，同時(shí)也說(shuō)明在液體授粉前將ClO2加入花粉溶液進(jìn)行花粉中Psa消毒在獼猴桃栽培生產(chǎn)中有比較廣闊的應(yīng)用前景。

圖3 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃單果重的影響Figure 3 Effects of three kinds of medicament on weight of single kiwifruit (n=3)

圖4 3種藥劑處理對(duì)獼猴桃種子數(shù)的影響Figure 4 Effects of three kinds of medicament on on seed number of kiwifruit (n=3)

3 結(jié)論

被Psa污染的花粉以10 mg/L ClO2溶液處理45 min對(duì)花粉中Psa的殺菌率為99.7%，而花粉生活力僅下降0.5%、座果率下降12%、總產(chǎn)量下降5.6%、單果重下降6%、種子數(shù)下降1.2%，表明10 mg/L ClO2溶液處理45 min對(duì)花粉中Psa殺菌率高，花粉生活力影響小，在生產(chǎn)上能有效防止獼猴桃花粉傳播Psa，具有較大的推廣價(jià)值。前人的研究方法對(duì)花粉的生活力影響較大，本研究方法對(duì)花粉的生活力影響較小，但在授粉時(shí)需要將花粉配制成液體，加大了授粉難度，生產(chǎn)上一般選用干粉授粉，因此后續(xù)的試驗(yàn)可深入研究干粉授粉，降低授粉難度。

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