丁小燕 - 張 雯 倪 莉 劉志彬 -

(1. 福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350108；2. 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350108；3. 百威英博投資﹝中國﹞有限公司，湖北 武漢 430050)

中國是禽肉生產(chǎn)的大國，雞骨作為雞肉加工過程中的副產(chǎn)品，其產(chǎn)量逐年上升。雞骨中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、軟骨素、酸性黏多糖和維生素A、B1、B2等多種營養(yǎng)素[1]。其中，雞骨的蛋白質(zhì)含量可達(dá)16.3%，與等量雞肉相似，并且氨基酸含量高，比例均衡，生物價高，是優(yōu)質(zhì)的蛋白源[2]。因此，雞骨具有很高的市場利用價值。

但由于雞骨無法直接食用，目前雞骨資源開發(fā)利用率較低，主要被加工為骨粉作為動物飼料使用，產(chǎn)品附加值低[3]。利用蛋白酶適度水解，可改善其溶解性、乳化性、起泡性及持水性，從而提高其利用效率。目前已有多篇文獻(xiàn)[4-6]報道了雞骨泥的蛋白酶水解研究，但水解效率有待提高。另一方面，酶法水解動物蛋白產(chǎn)物容易產(chǎn)生苦味、腥味等不良風(fēng)味[7]，需進(jìn)一步改進(jìn)雞骨泥的水解工藝。本試驗(yàn)擬以雞肉加工的副產(chǎn)品雞骨泥為原料，通過雙酶協(xié)同作用對原料進(jìn)行充分水解以提高原料的綜合利用率，并降低產(chǎn)品的腥味和苦味以提高產(chǎn)品品質(zhì)。旨在為提高雞骨的綜合利用率提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶(酶活力2.7×104U/g)、Protamex復(fù)合蛋白酶(酶活力2.0×105U/g)、Alcalase水解蛋白酶(酶活力3.5×105U/g)：丹麥諾維信公司；

AS.1398中性蛋白酶：酶活力6.0×104U/g，無錫星達(dá)生物有限公司；

胰蛋白酶(酶活力7.4×104U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力8.0×104U/g)：北京華美公司；

中性蛋白酶：酶活力2.7×104U/g，浙江大學(xué)食品工程系提供；

新鮮雞腿骨：福建圣農(nóng)集團(tuán)有限公司；

其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

高效液相色譜儀：L-2000型，配置L-2455型二極管陣列檢測器，日本日立公司；

電子天平：TE601-L型，德國賽多利斯公司；

高速冷凍離心機(jī)：CF16RXⅡ型，日本日立公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，上海申騰科技有限公司；

pH計：868型，美國Orion Research公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程 新鮮雞腿骨經(jīng)清水清洗后剔除腿骨肉，使用粉碎機(jī)將其粉碎至約80目形成雞骨泥，然后90 ℃水浴30 min，經(jīng)冷卻后將雞骨泥pH調(diào)至各蛋白酶的最適pH。添加酶液在最適反應(yīng)溫度下水解一定時間，然后85 ℃水浴20 min滅酶，最后使用雙層紗布濾去不溶性成分，獲得雞骨泥的酶解液。

1.3.2 酶解液的分析 采用SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》測定蛋白酶的活力；采用甲醛電位滴定法測定樣品的氨態(tài)氮，并計算氮回收率[8]；采用Alder-Nissen法計算水解度(DH)和平均肽鏈長度[9]；采用Waters AccQ-Tag衍生法進(jìn)行氨基酸組分的分析[10]。

1.3.3 雞骨泥水解蛋白酶的篩選 選用Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶、Protamex復(fù)合蛋白酶、Alcalase水解蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、AS.1398中性蛋白酶和木瓜蛋白酶7種蛋白酶，在其各自的最適條件下對雞骨泥進(jìn)行水解，測定水解液中蛋白質(zhì)水解度、氮收率、水解液的風(fēng)味以及水解液澄清情況，從而初步篩選適當(dāng)雞骨泥水解蛋白酶。在此基礎(chǔ)上，選擇恰當(dāng)?shù)碾p酶組合對雞骨泥進(jìn)行水解，以雞骨泥水解度(DH)為指標(biāo)篩選最佳的雙酶組合。

1.3.4 雞骨泥水解工藝的優(yōu)化 在確定最佳雙酶組合后，以雞骨泥水解度(DH)為指標(biāo)，對比分步水解(酶分先后加入)和同步水解(酶同時加入)兩種酶添加方式，確定該雙酶組合的最佳復(fù)合方式。最后采用四因素四水平正交試驗(yàn)[11]考察溫度、pH、酶解時間和酶添加量對雞骨泥水解度(DH)的影響，優(yōu)化雞骨泥的水解工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的初步篩選

由表1可知，7種蛋白酶對雞骨泥的水解效果不同，采用AS.1398中性蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase、Protamex和胰蛋白酶水解雞骨蛋白時，水解度、氮收率較高，但苦味重，水解液較渾濁。采用木瓜蛋白酶和Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶時，雖然氮收率較低，但水解液苦味弱，且易于澄清處理。為了提高酶解效率，并提升產(chǎn)品風(fēng)味，將水解效率較高的3種蛋白酶(AS.1398中性蛋白酶、中性蛋白酶和Alcalase)與產(chǎn)品風(fēng)味較好的2種蛋白酶(木瓜蛋白酶和Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶)結(jié)合，進(jìn)行雙酶水解雞骨泥。為了簡化試驗(yàn)，選擇4種組合方式：① 中性蛋白酶+Flavourzyme；② AS.1398中性蛋白酶+Flavourzyme；③ Alcalase+Flavourzyme；④ 中性蛋白酶+木瓜蛋白酶。

表1 各蛋白酶對雞骨泥的水解效果Table 1 The effect of protease types on the hydrolysis of chicken bone paste

2.2 最佳雙酶組合的篩選

反應(yīng)溫度、pH、底物濃度、加酶量和反應(yīng)時間是蛋白質(zhì)酶解的重要工藝參數(shù)，參考預(yù)備試驗(yàn)的數(shù)據(jù)(表2)分別在中性蛋白酶、AS.1398中性蛋白酶、Alcalase反應(yīng)1 h的基礎(chǔ)上加入Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶或木瓜蛋白酶進(jìn)行水解試驗(yàn)，以水解度(DH)為指標(biāo)篩選最佳的雙酶組合，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，除中性蛋白酶+木瓜蛋白酶組合外，其它組合雞骨泥分別經(jīng)Alcalase、中性蛋白酶、AS.1398中性蛋白酶水解1 h后再加入Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶，水解效果有明顯改善，較單酶水解的顯著提高。其中水解度高低順序排列為：中性蛋白酶+Flavourzyme >AS.1398中性蛋白酶+Flavourzyme>Alcalase+Flavourzyme>中性蛋白酶+木瓜蛋白酶。經(jīng)測定，中性蛋白酶+Flavourzyme的雙酶組合水解度可達(dá)40%，氮回收率約為90%，而且所得酶解液澄清、無苦味和異味，因此選擇該組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 雙酶水解工藝的優(yōu)化

2.3.1 雙酶復(fù)合方式的確定 用中性蛋白酶與Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶對雞骨蛋白進(jìn)行復(fù)合水解，分步水解時，控制反應(yīng)體系的溫度為50 ℃，pH為8.5，加入中性蛋白酶，反應(yīng)1 h后調(diào)整反應(yīng)體系的pH為7.0，再加入Flavourzyme進(jìn)行水解；同步水解時，控制反應(yīng)體系的溫度為50 ℃，pH為8.5，將中性蛋白酶與Flavourzyme共同加入反應(yīng)體系進(jìn)行水解。對比兩種水解方式的效率，結(jié)果見圖2。

表2 蛋白酶的最佳反應(yīng)條件Table 2 The optimum enzymolysis conditions of each protease

圖1 雙酶組合對雞骨泥的水解效果

Figure 1 The degree of hydrolysis on chicken bone paste with binary protease combination

由圖2可知，分步水解時，中性蛋白酶水解1 h后加入Flavourzyme，水解度明顯增大，與同步水解相比，兩種工藝對于反應(yīng)體系的影響并不顯著，為了簡化試驗(yàn)工藝，采用同步水解的工藝進(jìn)行水解。

圖2 中性蛋白酶與Flavourzyme的添加方式 對雞骨泥的水解效果

Figure 2 The degree of hydrolysis on chicken bone paste with neutral protease and Flavourzyme under different addition methods

2.3.2 酶解條件的優(yōu)化 在確定雙酶復(fù)合方式后，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件。參考中性蛋白酶和Flavourzyme單酶水解時的各因素(包括溫度、pH、時間和加酶量)參數(shù)，從而確定復(fù)合酶解時每個因素的條件區(qū)間，再進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平取值見表3，結(jié)果見表4。

表3 正交因素水平表?Table 3 Orthogonal factor level

? 加酶量占底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表4 L16(45)正交設(shè)計方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The L16 (45) orthogonal design and results

從正交試驗(yàn)極差結(jié)果顯示，各因素的影響次序?yàn)镃>D>A>B，最適宜的工藝參數(shù)為A3B4C4D4或A3B4C4D3，即溫度為50 ℃，pH值為8.5，水解時間2.5 h，中性蛋白酶與Flavourzyme的酶底比分別為0.75%，2.00%或0.75%，1.50%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的成本和能源消耗，確定最佳工藝條件為A3B4C4D3，即溫度50 ℃，pH 8.5，中性蛋白酶與Flavourzyme的酶底比為0.75%，1.50%，底物濃度5%，水解時間為2.5 h。通過驗(yàn)證，酶雞骨泥的水解度達(dá)38.96%。該酶解度顯著優(yōu)于汪蘭等[5]所報道的使用木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶水解雞骨泥所獲得的水解度(16.5%)；也優(yōu)于馬亞萍等[6]所報道的使用復(fù)合蛋白酶水解雞骨渣所獲得的水解度(25.88%)。經(jīng)分析，酶解產(chǎn)物的平均肽鏈長度為2.57，產(chǎn)品多為短肽和游離氨基酸，易于人體消化吸收。

2.4 雞骨泥及其酶解液游離氨基酸成分分析

對比分析水解前后雞骨泥的游離氨基酸組成，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，酶解液中共檢測到18種游離氨基酸，其中必需氨基酸含量為53%。游離氨基酸總量達(dá)3 936.70 mg/L，是酶解前的2倍，尤其是亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)等的含量顯著增加。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對比了7種蛋白酶及其雙酶組合對雞骨泥的水解效果，確定中性蛋白酶與Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味酶的組合水解效果最佳。還通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了酶解工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在酶解溫度50 ℃、pH值8.5、中性蛋白酶和Flavourzyme的加酶量分別為0.75%和1.50%、底物濃度5%、水解時間2.5 h 條件下酶解效率最高，水解度和氮收率分別為37.11%和92.5%，酶解產(chǎn)物澄清無苦味及腥味。經(jīng)酶解后，雞骨泥的游離氨基酸含量顯著增加，尤其是亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸等含量顯著提高。本試驗(yàn)所開發(fā)的雙酶水解雞骨泥工藝對提高雞骨利用效率有一定的應(yīng)用價值。

圖3 酶解后游離氨基酸組成的變化Figure 3 The changes of free amino acid before and after enzymatic hydrolysis

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