李莉紅，龐文彪，常凱，閻小艷，高繼萍，宋國(guó)華

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)已經(jīng)成為眾多癌癥中最常見(jiàn)的一種頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，并且趨于年輕化[1]。研究發(fā)現(xiàn)，OSCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多層面調(diào)控過(guò)程，包括從DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白表達(dá)水平都參與病變過(guò)程[2]。miRNA不僅與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)，而且與許多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)共同構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮多種生物學(xué)作用，成為近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。miRNA與靶mRNA完全或不完全結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)、細(xì)胞增殖凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過(guò)程參與口腔癌的發(fā)生發(fā)展[3-5]。因此，為進(jìn)一步了解OSCC發(fā)生和發(fā)展相關(guān)miRNA參與的生物學(xué)過(guò)程，為疾病的分級(jí)、早期診斷及治療提供重要的信息，本文將采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建中國(guó)地鼠口腔頰黏膜癌中miRNA和mRNA表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)的miRNA和mRNA并進(jìn)行二者關(guān)聯(lián)分析，探討miRNA在OSCC發(fā)生發(fā)展中的靶向調(diào)控作用，為尋找新的更好的腫瘤標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

60只8～10周齡清潔級(jí)中國(guó)地鼠，雄性，體重 25～35 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(晉)2015-0001】，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境【SYXK(晉)2015-0001】。隨機(jī)分為三組，分別為空白對(duì)照組(24只)、溶劑對(duì)照組(12只)、模型組(24只)。隔天上午用小頭棉簽在模型組中國(guó)地鼠雙側(cè)頰囊涂擦0.5% DMBA丙酮液，并禁食禁水2 h。分別在第6、9、12、15周進(jìn)行處死取頰囊組織，一部分低溫保存，一部分進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。病理學(xué)結(jié)果詳見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中國(guó)地鼠期間按照山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，并通過(guò)倫理審核。本實(shí)驗(yàn)選取15周鑒定為鱗癌的3個(gè)凍存組織和3個(gè)正常組織作為本實(shí)驗(yàn)的研究材料。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建差異miRNA表達(dá)譜

分別從所取得樣本中提取總RNA，經(jīng)質(zhì)檢合格后，對(duì)總RNA片段化處理，分離膠技術(shù)回收18～35nt的RNA片段，加接頭逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到組織樣本的測(cè)序文庫(kù)。采用Illumina HiSeq 2500 高通量測(cè)序平臺(tái)[7]對(duì)組織樣本的miRNA進(jìn)行測(cè)序，得到原始數(shù)據(jù)之后進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量以及片段化選擇等處理，獲得目標(biāo)序列。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 21)中的基因注釋信息，與已知miRNA進(jìn)行比對(duì)[8]，采用miRDeep2軟件預(yù)測(cè)新miRNA[9]，構(gòu)建OSCC組織和正常組織的miRNA表達(dá)譜。分別將兩組織的miRNA的表達(dá)量歸一化，計(jì)算出RPM值(每百萬(wàn)條測(cè)序序列中出現(xiàn)的目標(biāo)序列的數(shù)量)，比較分析兩組織中顯著差異表達(dá)的miRNA [篩選條件：padj<0.05且|log2(Fold Change)|≥ 1 (Fold Change表示鱗癌組和正常組表達(dá)量的倍數(shù)變化)]。

1.2.2 構(gòu)建差異mRNA表達(dá)譜

總RNA質(zhì)檢合格后用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入fragmentation buffer片段化，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成cDNA第二鏈，用QIAQuick PCR試劑盒純化后加EB緩沖液、雙聯(lián)cDNA末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭、2%瓊脂糖凝膠電泳回收、PCR擴(kuò)增，得到組織樣品測(cè)序文庫(kù)。采用Illumina HiSeq 2500 高通量測(cè)序平臺(tái)提供的PE100測(cè)序策略對(duì)組織樣本的mRNA進(jìn)行測(cè)序。同miRNA一樣得到Clean Reads后采用TopHat軟件(v2.0.12)[10]和Bowtie2軟件[11]與UCSC (University of California Santa Cruz) 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的Cricetulus griseus參考基因組比對(duì)分析，構(gòu)建mRNA表達(dá)譜。分別將兩組織的mRNA的表達(dá)量歸一化，計(jì)算出RPKM值[12]，采用DEGseq[13]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析[篩選條件：P<0.05且|log2(Fold Change)|≥ 1]。

1.2.3 OSCC和正常組織中差異表達(dá)miRNA/mRNA對(duì)接

應(yīng)用Gene Ontology功能富集和KEGG Pathway分析，將1.2和1.3的結(jié)果關(guān)聯(lián)分析，預(yù)測(cè)與OSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)性較高的miRNA和mRNA。

2 結(jié)果

2.1 OSCC和正常組織中差異miRNA表達(dá)譜

2.1.1 已知miRNA表達(dá)譜

對(duì)照OSCC和正常組織中已知的miRNA，共有268個(gè)miRNA差異表達(dá)，其中137個(gè)表達(dá)上調(diào)，131個(gè)表達(dá)下調(diào)，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。進(jìn)一步對(duì)差異miRNA進(jìn)行深度分析，顯著差異的miRNA共有11個(gè)，其中上調(diào)的miRNA有8個(gè)，下調(diào)的有3個(gè)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.2 新的miRNA表達(dá)譜

經(jīng)過(guò)分析統(tǒng)計(jì)共發(fā)現(xiàn)了208個(gè)新miRNA，其中有112個(gè)表達(dá)上調(diào)，96個(gè)表達(dá)下調(diào)，結(jié)果見(jiàn)圖2。進(jìn)一步深度分析，得到顯著差異的miRNA共有3個(gè)，其中上調(diào)的miRNA有1個(gè)，下調(diào)的有2個(gè)。與正常組相比，上調(diào)的miRNA有Novel-118，padj(padj為校正之后的P值)為9.63E-06；下調(diào)的有Novel-117和Novel-135，padj值均為0.0412。

表1 口腔頰黏膜鱗癌組織和正常組織中顯著差異表達(dá)的已知miRNATab.1 Significant differentially expressed known miRNA between OSCC and normal groups

注：padj為校正之后的P值；Fold Change表示鱗癌組和正常組表達(dá)量的倍數(shù)變化。

Note. Padj is the correctedPvalue. Fold change indicates the multiple changes in the expression of OSCC and normal group.

圖1 口腔頰黏膜鱗癌組織和正常組織的差異表達(dá)miRNA柱狀圖和餅狀圖Fig.1 Histogram (A) and pie chart (B) of differentially expressed known miRNA between OSCC and normal groups

圖2 口腔頰囊黏膜鱗癌組織和正常組織的新miRNA差異表達(dá)柱狀圖和餅狀圖Fig.2 Histogram (A) and pie chart (B) of differentially expressed novel miRNA between the OSCC and normal groups

2.2 OSCC和正常組織中差異mRNA表達(dá)譜

對(duì)照OSCC和正常組織中的mRNA進(jìn)行分析，篩選后共檢測(cè)出194個(gè)基因表達(dá)差異，其中128個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，66個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，結(jié)果見(jiàn)圖3。口腔頰囊黏膜鱗癌組織和正常頰囊黏膜組織中差異表達(dá)前30位的基因見(jiàn)表2。

表2 口腔頰囊黏膜鱗癌組織和正常組織中前30位差異表達(dá)基因Tab.2 Differentially expressed genes in the top 30 between OSCC and normal groups

注：CorrectedP-value*為校正之后的P值；Ratio為Fold Change；Fold Change表示鱗癌組和正常組表達(dá)量的倍數(shù)變化。

Note. CorrectedP-value* is the correctedPvalue; Ratio is Fold Change; Fold Change indicates the multiple changes in the expression of OSCC and normal groups.

圖3 口腔頰囊黏膜鱗癌組織和正常組織的差異表達(dá)基因柱狀圖和餅狀圖Fig.3 Histogram (A) and pie chart (B) of differentially expressed genes between OSCC and normal groups

2.3 OSCC組織中差異表達(dá)miRNA/mRNA的對(duì)接研究

大量的研究證實(shí)，miRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)mRNA降解或抑制其翻譯。據(jù)此，miRNA的表達(dá)水平應(yīng)與其靶mRNA的表達(dá)水平相反，利用這一調(diào)節(jié)機(jī)制我們將轉(zhuǎn)錄組差異基因庫(kù)和miRNA測(cè)序獲得的差異的靶基因庫(kù)做交集，找出兩庫(kù)重合基因，然后根據(jù)上調(diào)miRNA得到下調(diào)差異靶基因，下調(diào)miRNA得到上調(diào)差異靶基因。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，中國(guó)地鼠口腔頰囊黏膜鱗癌組織與正常組織中顯著差異表達(dá)的11個(gè) miRNA 中有8個(gè)關(guān)聯(lián)到差異靶基因，其中有 5 個(gè) miRNA 上調(diào)(cgr-miR-21-3p，cgr-miR-34b-5p，cgr-miR-542-3p，cgr-miR-130-3p，cgr-miR-34c-5p)，3 個(gè) miRNA 下調(diào)(cgr-miR-499-5p，cgr-miR-486-3p，cgr-miR-504)。

但是，由于miRNA 與mRNA靶向調(diào)控關(guān)系是一對(duì)多，多對(duì)一的關(guān)系，即單個(gè)miRNA 可以靶向調(diào)控多個(gè)基因，多個(gè)miRNA靶向調(diào)控某個(gè)基因，因此，并不是上調(diào)的每個(gè)miRNA所靶向的每個(gè)基因都是呈現(xiàn)低表達(dá)，下調(diào)的每個(gè)miRNA所靶向的每個(gè)基因都是呈現(xiàn)高表達(dá)。最終，我們得到靶向調(diào)控的5個(gè)基因下調(diào)(Ttn，Ryr1，Tgm7，Pfkm，LOC100766767)，靶向參與上調(diào)的基因有 14 個(gè)(Slc1a1，Islr2，Hoxa1，Thbs1，Inhbb，Palm，Gpr176，F(xiàn)kbp10，F(xiàn)am71f2，C1qtnf6，Krt19，LOC100767496，LOC100765213，LOC100762478)(如圖4所示)。因新預(yù)測(cè)出的顯著差異的miRNA在與基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí)未發(fā)現(xiàn)靶基因，故后續(xù)不再研究。

圖4 顯著差異表達(dá)的已知miRNA及其差異表達(dá)靶基因統(tǒng)計(jì)Fig.4 Summary of significantly differentially expressed miRNA and its differentially expressed target genes

進(jìn)一步根據(jù)顯著差異表達(dá)的miRNA和基因表達(dá)的相關(guān)性構(gòu)建miRNA-基因作用網(wǎng)絡(luò)(如圖5所示)。橢圓形表示基因，菱形表示miRNA，相互作用用直線表示。

3 討論

圖5 顯著差異表達(dá)miRNA與差異表達(dá)靶基因的通路圖Fig.5 Pathway map between significantly differentially expressed miRNA and differentially expressed target genes

OSCC是一種嚴(yán)重威脅生命的惡性腫瘤。由于廣泛危險(xiǎn)因素的聯(lián)系，以及不可預(yù)測(cè)的治療結(jié)果使OSCC成為最復(fù)雜的癌癥之一。目前盡管已有許多治療方式，但是在過(guò)去的40年里，OSCC患者的5年生存率并沒(méi)有超過(guò)50%[14-15]。大量的證據(jù)表明，miRNA不僅可以作為癌癥的診斷和預(yù)后標(biāo)記，而且還能提供靶向治療的靶點(diǎn)[16]。其在轉(zhuǎn)錄后水平上使靶mRNA降解，也可以與靶mRNA不完全互補(bǔ)在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達(dá)[17]。新一代高通量測(cè)序技術(shù)是近十年來(lái)逐步從新技術(shù)成長(zhǎng)為主流的測(cè)序技術(shù)，以其簡(jiǎn)單、快速、高分辨率和高通量的特點(diǎn)，在腫瘤研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[18]，但是在口腔癌的研究中應(yīng)用鮮少。本研究首次在中國(guó)地鼠中成功構(gòu)建口腔頰黏膜癌miRNA和mRNA的表達(dá)譜，對(duì)研究口腔頰黏膜癌機(jī)制具有參考意義。

大量研究表明，miRNA通過(guò)靶向mRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在許多腫瘤中miR-21[19]，miR-130[20]，miR-142[21]表達(dá)上調(diào)，而miR-486[22]表達(dá)下調(diào)。我們此次miRNA測(cè)序結(jié)果顯示，cgr-miR-21-3p、cgr-miR-21-5p、cgr-miR-130b-3p、cgr-miR-142-5p表達(dá)量升高，cgr-miR-486-3p降低，與口腔黏膜正常組織比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這充分顯示與OSCC相關(guān)的miRNA的表達(dá)水平與已有研究一致，證實(shí)了測(cè)序結(jié)果可信。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中，我們得到了194差異表達(dá)的基因。從前30位差異表達(dá)的基因看出，這些基因主要是促炎與抗炎因子、促瘤與抑瘤因子，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族中的MMP9、MMP13在多項(xiàng)口腔鱗癌研究中已經(jīng)證實(shí)顯著高表達(dá)[23-24]；趨化因子CXCL2、CXCL3由Peng[25]在大鼠口腔鱗癌微陣列芯片分析中檢測(cè)出顯著高表達(dá)。這些研究表明：與口腔癌相關(guān)的差異表達(dá)基因的表達(dá)水平與本實(shí)驗(yàn)一致，在OSCC的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。

從聯(lián)合分析的結(jié)果來(lái)看，一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)靶基因，如：cgr-miR-21-3p、cgr-miR-542-3p、cgr-miR-34c-5p、cgr-miR-486-3p、cgr-miR-504。同樣，一個(gè)基因被多個(gè)miRNA調(diào)控，如：Ttn、C1qtnf6、Ryr 1。據(jù)報(bào)道，功能失調(diào)的miR-21-3p在卵巢癌細(xì)胞中通過(guò)靶向基因RBPMS、RCBTB1、ZNF608和NAV3促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲[26-27]。miR-542-3p在結(jié)腸直腸癌中靶向基因OTUB1、CTTN抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移[28-29]。Gandla等[30]研究惡性癌癥疼痛時(shí)，深入的生物信息學(xué)分析顯示，在miR-34c-5p的高度靶向的目標(biāo)基因中，有Cav2.3、12 P2rx6、Oprd1和Oprm1。至于miR-486-3p，目前沒(méi)有直接的研究指明其在口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用以及如何調(diào)控OSCC機(jī)制，但是有肺癌中miR-486-5p通過(guò)下調(diào)促癌基因Arhgap5和胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤抑制基因被確定為腫瘤抑制基因，其表達(dá)在血漿樣品中也得到驗(yàn)證[31-33]。MiR-504通過(guò)直接結(jié)合腫瘤抑制基因TP53的3′-UTR和靶基因FOXP1影響細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞的生長(zhǎng)[34-35]。以上研究雖未在口腔癌中充分證實(shí)，但也暗示出一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)基因，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Pfhler等[36]研究發(fā)現(xiàn) TTN作為存在于黑色素瘤相關(guān)性視網(wǎng)膜病患者的血清抗體中的抗原，是黑色素瘤潛在的生物標(biāo)記，可能具有致癌作用。C1qtnf6是重組人補(bǔ)體腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6，在卵巢癌患者血清和卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)，C1qtnf6可抑制 IL-8 /VEGF通路從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[37]。蘭尼堿受體1 (ryanodine receptors 1, Ryr 1)是一種同種四聚體鈣離子通道蛋白，有學(xué)者采用基因沉默技術(shù)，使肺癌細(xì)胞中的 Ryr1基因表達(dá)下調(diào)，證實(shí)Ryr1基因沉默可使細(xì)胞增殖能力下降，使細(xì)胞凋亡率顯著增高，進(jìn)而證實(shí)Ryr1基因沉默可使肺癌細(xì)胞生物學(xué)活性減低，使腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制[38]。雖然目前還沒(méi)有基因Ttn、C1qtnf6、Ryr1被多個(gè)miRNA調(diào)控的報(bào)道，但是已有許多生物測(cè)序?qū)嶒?yàn)如：廖江銓等[39]在冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究時(shí)得到，基因CTSB可以被hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-106b-5p和hsa-miR-20b-5p調(diào)節(jié)，而RTKN2可被hsa-miR-3158-3p和novel-m9052-5p調(diào)控，暗示我們的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析選出的基因Ttn、C1qtnf6、Ryr1被多個(gè)miRNA調(diào)控的結(jié)果是可信的。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)OSCC和正常組織中miRNA和mRNA表達(dá)譜的建立以及二者聯(lián)合分析，使我們更加深入的了解到：一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)mRNA，同時(shí)一個(gè)mRNA可由多個(gè)miRNA調(diào)控，它們相互作用形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在口腔癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為口腔癌的發(fā)生、發(fā)病機(jī)制，及臨床治療及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)，同時(shí)也為我們篩選口腔癌標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。

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