徐孝平，徐劍欽，黃俊杰，劉軍平，陳方明，蔡兆偉，蔡月琴，潘永明

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種臨床常見的胃腸功能紊亂性疾病。主要表現(xiàn)為慢性腹痛、腹脹伴排便習(xí)慣改變及大便性狀異常，但缺乏臨床能發(fā)現(xiàn)的可解釋上述癥狀的器質(zhì)性病變。IBS的患病率呈逐年上升趨勢(shì)，相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示IBS的患病率為10%～20%[1]，目前IBS的病因及具體的病理生理機(jī)制并不十分清楚，研究認(rèn)為可能與精神心理異常、胃腸運(yùn)動(dòng)障礙、內(nèi)臟感覺(jué)異常、腦腸軸調(diào)節(jié)異常、胃腸道感染及腸道菌群失調(diào)等多方面因素有關(guān)。越來(lái)越多的研究顯示，腸道菌群在IBS疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[2]。

目前IBS動(dòng)物模型制作大致可分為兩類[3]，一類以刺激中樞為靶點(diǎn)，如采用母嬰分離、束縛加制動(dòng)應(yīng)激、冰水刺激或神經(jīng)中樞內(nèi)注射促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotrophin releasing factor, CRF)等；另一類以刺激外周為靶點(diǎn)，一般發(fā)生在胃腸道感染后發(fā)生的持續(xù)性的胃腸道功能異常，如短暫的旋毛蟲感染、直腸內(nèi)注射化學(xué)刺激物三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid solution, TNBS)、乙酸灌胃等。盡管如此，IBS還尚無(wú)統(tǒng)一公認(rèn)的動(dòng)物模型，但由于IBS受社會(huì)—心理—神經(jīng)內(nèi)分泌—免疫等多因素下的致病條件，IBS造模因素已從單一因素逐漸轉(zhuǎn)向復(fù)合因素的造模方法，但大多以大鼠為模型動(dòng)物，但近來(lái)也已有報(bào)道用兔為模型動(dòng)物建立IBS模型[4-5]。WHBE兔是本中心從日本大耳白兔(Japanese white rabbit, JW兔)生產(chǎn)群中發(fā)現(xiàn)并定向培育而建立的新實(shí)驗(yàn)兔封閉群，本項(xiàng)目組前期運(yùn)用濕熱應(yīng)激加灌服番瀉葉煎劑的方法，已成功建立了穩(wěn)定的IBS模型，并發(fā)現(xiàn)WHBE兔對(duì)環(huán)境應(yīng)激敏感，容易出現(xiàn)IBS癥狀[4]。結(jié)合前期的工作，本課題組認(rèn)為應(yīng)用兔作為IBS模型動(dòng)物可能具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：(1)兔體內(nèi)代謝旺盛，產(chǎn)熱多，汗腺少，耐熱力差，并對(duì)濕熱環(huán)境溫度變化敏感，符合IBS中醫(yī)“情志致病”的條件；(2)體型適中、單籠飼養(yǎng)，便于開展血液、糞便等樣品的多次采集；(3)兔腦體積大小適中，易于與IBS相關(guān)的腦區(qū)影像學(xué)檢查，有利于從腦-腸軸角度探討IBS；(4)相比大鼠，兔盲腸發(fā)達(dá)和代謝快，用番瀉葉刺激可加速腸道功能紊亂，易于IBS發(fā)生，符合IBS中醫(yī)“肝郁乘脾”的致病機(jī)理。因此，本研究在前期IBS造?；A(chǔ)上，運(yùn)用16S rDNA高通量測(cè)序并分析，觀察WHBE兔和JW兔IBS造模前后腸道菌群的變化及相互的差異，探討腸道菌群在IBS疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及影響，探討WHBE兔在IBS發(fā)生中是否存在更為特殊的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，為WHBE兔在IBS研究中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)WHBE兔和JW兔各16只，體重為2.0～2.5 kg，雌雄各半，肛門四周干凈，無(wú)排軟便、稀便，由新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場(chǎng)提供【SCXK(浙)2015-0004】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通環(huán)境設(shè)施中【SYXK(浙)2013-0184】，室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度60%～70%，所有操作均通過(guò)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC批準(zhǔn)文號(hào)：ZSLL-2016-131)。

1.2 主要儀器和試劑

儀器：GZX -9240 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅，中國(guó))，TJ6K天子天平(常熟雙杰，中國(guó))，E12140電子分析天平(OHAUS，美國(guó))，L96G梯度型PCR儀(朗基科儀，中國(guó))，MiSeq測(cè)序系統(tǒng)(Illumina，美國(guó))。試劑和藥品：Premix Ex TaqTM Hot Start Version(Takara，RR030 A)，DL2000 DNA Marker(Takara，3427)，自制番瀉葉煎劑(0.3 g生藥/mL)。

1.3 兔IBS模型的建立

WHBE兔和JW兔經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，按體重隨機(jī)分成4組，每組8只，雌雄各半，即WHBE兔正常對(duì)照組(WHBE rabbit NC group)、WHBE兔IBS模型組(WHBE rabbit IBS model group)、JW兔正常對(duì)照組(JW rabbit NC group)、JW兔IBS模型組(JW rabbit IBS model group)。按文獻(xiàn)[4]建立實(shí)驗(yàn)兔IBS模型，IBS模型組實(shí)驗(yàn)兔在溫度為37～39℃，相對(duì)濕度為100%的環(huán)境下每天上午開始濕熱應(yīng)激4 h，連續(xù)應(yīng)激7 d，濕熱期間不予飲食。第7天下午開始經(jīng)口灌服10 mL/kg致瀉劑番瀉葉煎劑(0.3 g生藥/mL)，直至第14天結(jié)束，同時(shí)在造模期間飼料減半。正常對(duì)照組不做濕熱應(yīng)激，第7天開始經(jīng)口灌服10 mL/kg的蒸餾水，直至第14天結(jié)束。

1.4 指標(biāo)觀察

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察

實(shí)驗(yàn)期間觀察動(dòng)物的精神活動(dòng)狀態(tài)、飲水、飲食、糞便等一般情況，并記錄體重、腹圍長(zhǎng)度，計(jì)算腹圍指數(shù)和變化率，腹圍指數(shù)=腹圍長(zhǎng)度/體重，變化率=(造模后 -造模前)/造模前×100%。

1.4.2 糞便含水量觀察

造模期間每天觀察實(shí)驗(yàn)兔的糞便情況，并在造模0、5、9、14 d時(shí)收集糞便，稱取濕重后，置于100℃恒溫烘箱中烘干4 h后稱重，計(jì)算糞便含水量，即(糞便濕重-糞便干重)/糞便濕重×100%。

1.4.3 結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能

兔實(shí)驗(yàn)前禁食，將實(shí)驗(yàn)兔固定于固定架上，然后用自制推夾器將直徑6 mm的鋼珠放入距肛門8～9 cm直腸內(nèi)，此時(shí)開始計(jì)時(shí)，觀察直腸內(nèi)鋼珠排出的時(shí)間。

1.4.4 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

動(dòng)物處死后取部分結(jié)腸，立即用生理鹽水沖洗，肉眼初步觀察有無(wú)器質(zhì)性病變；用4%中性甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.5 兔結(jié)腸內(nèi)容物的16S rDNA測(cè)序

造模14 d后麻醉處死動(dòng)物，立即將兔腹部剃毛并用碘酒-酒精反復(fù)擦拭皮膚后，放在無(wú)菌操作工作臺(tái)內(nèi)，沿腹中線切開打開腹腔，取兔結(jié)腸上端的內(nèi)容物，置入無(wú)菌凍存管中，-80℃保存。用DNA抽提試劑盒提取腸道內(nèi)容物總DNA。使用Phusion酶擴(kuò)增相應(yīng)高可變區(qū)，使用DNA模板50 ng，25 μL的PCR體系，擴(kuò)增25～35個(gè)循環(huán)。所用引物序列為319F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。一輪擴(kuò)增反應(yīng)之后，在正反向引物兩端分別加上不同的adapters和barcodes，再進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成的PCR產(chǎn)物純化之后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和生物信息學(xué)分析

1.6.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.6.2 生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量?jī)?yōu)化，舍棄低質(zhì)量序列，連接序列，過(guò)濾連接的序列，獲得最終用于分析的序列。使用UPARSE軟件，按97%的相似度對(duì)所有優(yōu)化序列進(jìn)行OUT(operational taxonomy units)劃分。使用Mothur軟件，分別計(jì)算菌群多樣性指數(shù)Shannon、豐度指數(shù)Chao1。使用MetaStat軟件，在門和屬兩個(gè)水平分析對(duì)比各組的多個(gè)樣本，找出各組中百分比含量具有顯著差異的微生物類型，默認(rèn)閾值為0.05。

2 結(jié)果

2.1 WHBE兔和JW兔IBS模型腹圍指數(shù)變化率和糞便含水量的變化

在濕熱5 d后模型組動(dòng)物體重增長(zhǎng)緩慢，灌服致瀉劑后出現(xiàn)糞便變軟，粘液便，造模14 d時(shí)IBS模型組動(dòng)物出現(xiàn)糞便不成形、稀便、攝食量減少和活動(dòng)減少等癥狀。與正常對(duì)照組比，WHBE兔IBS模型組和JW兔IBS模型組分別在造模后第5天開始和第9天開始腹圍指數(shù)變化率均明顯升高(P<0.05,P<0.01)，且造模第14天時(shí)WHBE兔IBS模型組的腹圍指數(shù)變化率明顯高于JW兔IBS模型組(P<0.05)，見圖1A；另外，與正常對(duì)照組比，WHBE兔和JW兔IBS模型組糞便含水量均顯著升高(P<0.05,P<0.01)，見圖1B。

2.2 WHBE兔和JW兔IBS模型結(jié)腸運(yùn)轉(zhuǎn)功能的變化

與正常對(duì)照組比，造模14 d后WHBE兔和JW兔IBS模型組的結(jié)腸運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間均明顯減少(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

肉眼大體觀察顯示，各組實(shí)驗(yàn)兔的結(jié)腸黏膜無(wú)明顯充血、水腫或潰瘍，病理HE染色顯示，結(jié)腸組織中未見明顯的彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等組織學(xué)的異常改變。

注：與正常對(duì)照組比，*P <0.05,**P <0.01；WHBE兔和JW兔比較，# P <0.05。圖1 WHBE兔和JW兔IBS模型腹圍指數(shù)變化率和糞便含水量的變化Note.*P<0.05,**P<0.01, compared with the normal control group.#P<0.05, WHBE rabbits compared with JW rabbits.Fig.1 Changes of abdominal circumference index and fecal water content in the WHBE rabbits and JW rabbits with IBS

注：與正常對(duì)照組比，*P< 0.05,**P< 0.01；WHBE兔和JW兔比較，# P< 0.05。圖2 WHBE兔和JW兔IBS模型結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的變化Note.*P<0.05,**P<0.01, compared with the normal control group.#P<0.05, WHBE rabbits compared with JW rabbits.Fig.2 Changes of colonic transit time in the WHBE rabbits and JW rabbits with IBS

2.4 WHBE兔和JW兔的腸道菌群Alpha多樣性分析

OTU數(shù)量(相似水平97%以上)可以代表樣品物種的豐度。結(jié)果顯示，WHBE兔正常對(duì)照組OTU數(shù)量最多，且WHBE兔IBS模型OTU數(shù)量有所減少，但JW兔正常對(duì)照組和IBS模型組OTU數(shù)量差異不大。同時(shí)，Alpha多樣性通常用于度量群落生態(tài)中物種的豐富度，是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。Shannon指數(shù)是評(píng)估微生物多樣性的重要指數(shù)之一，它的值越大，說(shuō)明微生物群落多樣性越高。Chao1指數(shù)在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，數(shù)值越大代表群落豐度越高。與正常對(duì)照組比，WHBE兔和JW兔IBS模型組腸道菌群Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著下降(P<0.05)，另外，與JW兔相比，WHBE兔正常對(duì)照組和IBS模型組腸道菌群Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)均低于JW兔，但差異無(wú)顯著性。見表1。

表1 WHBE兔和JW兔的腸道菌群Alpha多樣性分析Tab.1 Alpha diversity analysis of intestinal microflora in the WHBE rabbits and JW rabbits

注：與正常對(duì)照組比，*P<0.05,**P<0.01；WHBE兔和JW兔比較，#P<0.05。

Note.*P<0.05,**P<0.01, compared with the normal control group.#P<0.05, WHBE rabbits compared with JW rabbits.

2.5 在門分類學(xué)水平上WHBE兔和JW兔腸道菌群相對(duì)豐度的比較

根據(jù)OTU分類分析的結(jié)果，由圖3 A可知WHBE兔和JW兔腸道菌群在門水平菌群組成分布主要有14種，其中占比重較多的前7種細(xì)菌門依次為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、軟壁菌門(Tenericutes)、藍(lán)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)，分別占所有菌群的99.57%和99.75%。其中厚壁菌門、擬桿菌門在WHBE兔或JW兔的整個(gè)兔腸道菌群中占主要部分(分別約94.93%和96.20%)，是腸道菌群中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。

與正常對(duì)照組比，WHBE兔IBS模型組厚壁菌門、疣微菌門和綠彎菌門(Chloroflexi)明顯下降(P<0.05,P<0.01)，而擬桿菌門明顯升高(P<0.01)，其余各菌門差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，JW兔IBS模型組各菌門差異無(wú)顯著性P> 0.05)；另外，WHBE兔正常對(duì)照組厚壁菌門明顯低于JW兔正常對(duì)照組(P<0.05)，而WHBE兔正常對(duì)照組擬桿菌門和疣微菌門明顯高于JW兔正常對(duì)照組(P<0.05,P<0.01)，其余各菌門差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)。此外，WHBE兔IBS模型組與JW兔IBS模型組除厚壁菌門和擬桿菌門存在差異外(P<0.01)，其余各菌門差異均無(wú)顯著性(P> 0.05)。見圖3B-3E。

注：與正常對(duì)照組比，*P <0.05,**P <0.01；WHBE兔和JW兔比較，#P <0.05,##P <0.01。圖A：各組在門水平的分類對(duì)比圖；圖B-E為各組有差異性菌群，依次為厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門和綠彎菌門。圖3 WHBE兔和JW兔在門水平上的微生物組成比較Note.*P<0.05,**P<0.01, compared with the normal control group. #P<0.05,##P <0.01, WHBE rabbits compared with JW rabbits. Fig. A, Comparison chart of classification of each group at phylum level. Fig. B-E, differential microflora in each group, in order of Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, and Chloroflexi.Fig.3 Comparison of microbial composition of WHBE rabbits and JW rabbits at phylum level

2.6 在屬分類學(xué)水平上各WHBE兔和JW兔腸道菌群相對(duì)豐度的比較

WHBE兔和JW兔腸道菌群種類在屬水平共有112種，其中WHBE兔正常對(duì)照組發(fā)現(xiàn)89個(gè)屬，WHBE兔IBS模型組發(fā)現(xiàn)106個(gè)屬，JW兔正常對(duì)照組發(fā)現(xiàn)106個(gè)屬，JW兔IBS模型組發(fā)現(xiàn)94個(gè)屬，見圖4。與正常對(duì)照組比，WHBE兔IBS模型組rc4-4菌屬顯著上升(P<0.05)，而Akk菌屬(Akkermansia)和鏈球菌屬(Streptococcus)顯著下降(P<0.05)；JW兔IBS模型組優(yōu)桿菌屬(Eubacterium)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum)顯著上升(P<0.05)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、糞桿菌屬(Coprobacter)、韋榮球菌屬(Veillonella)和鏈球菌屬(Streptococcus)均顯著下降(P<0.05)；另外，WHBE兔正常對(duì)照組優(yōu)桿菌屬(Eubacterium)、糞桿菌屬(Coprobacter)、Akk菌屬(Akkermansia)均顯著高于JW兔正常對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，而Odoribacter菌屬、韋榮球菌屬(Veillonella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)、Pseudoflavonifractor菌屬的相對(duì)豐度均顯著低于JW兔正常對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)；此外，WHBE兔IBS模型組rc4-4菌屬、糞桿菌屬(Coprobacter)、梭菌屬(Clostridium)均顯著高于JW兔IBS模型組(P<0.05，P<0.01)，而多爾氏菌屬(Dorea)、糞球菌屬(Coprococcus)和罕見小球菌屬(Subdoligranulum)均顯著低于JW兔模型對(duì)照組(P<0.05)。見圖5。

圖4 WHBE兔和JW兔在屬水平上的微生物組成比較Fig.4 Comparison of microbial composition in the WHBE rabbits and JW rabbits at genus level

注：與正常對(duì)照組比，*P <0.05,**P <0.01；WHBE兔和JW兔比較，#P <0.05,##P <0.01。圖A-C依次為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)中的差異菌屬。圖5 WHBE兔和JW兔在屬水平上的差異性菌屬Note.*P<0.05,**P<0.01, compared with the normal control group.#P<0.05,##P<0.01, WHBE rabbits compared with JW rabbits. Fig. A-C are the differential genera Firmicutes, Bacteroidetes and Verrucomicrobia, respectively.Fig.5 Differential genera of the WHBE rabbits and JW rabbits at genus level

3 討論

眾所周知，腸道菌群在IBS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。腸道菌群失調(diào)，可通過(guò)增加腸道產(chǎn)氣，引起腸道動(dòng)力紊亂，誘發(fā)腸黏膜免疫異常及提高內(nèi)臟敏感性多途徑引起其發(fā)病。疾病動(dòng)物模型作為研究疾病發(fā)生機(jī)制和藥物篩選的重要載體，本課題組前期發(fā)現(xiàn)WHBE兔應(yīng)對(duì)外界環(huán)境因素刺激后腸道反應(yīng)明顯，本研究在此基礎(chǔ)上成功復(fù)制了WHBE兔和JW兔IBS模型，但WHBE兔IBS模型不僅在腹圍指數(shù)變化明顯優(yōu)于JW兔，同時(shí)在糞便含水量、結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能等指標(biāo)的反應(yīng)一致性和穩(wěn)定性均優(yōu)于JW兔，證實(shí)了WHBE兔對(duì)腸道反應(yīng)敏感，相對(duì)更易誘發(fā)IBS。同時(shí)病理顯示結(jié)腸組織未見明顯的病理改變，這也符合IBS是一種功能性疾病的表現(xiàn)。

16S rDNA高通量測(cè)序分析被廣泛用于微生物多樣性及其定量、定性的分析，其中菌群多樣性是用于表示群落生態(tài)中物種的豐富度，是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。IBS與腸道微生態(tài)的研究表明IBS存在腸道菌群多樣性下降的現(xiàn)象。同樣，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)WHBE兔和JW兔IBS模型組Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均明顯降低，表明IBS模型菌群多樣性明顯降低。更有趣的是，正常狀態(tài)下，WHBE兔Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均低于JW兔，推測(cè)WHBE兔腸道菌群多樣性存在偏低的現(xiàn)象，更易發(fā)生菌群紊亂，這也為WHBE兔對(duì)環(huán)境因素刺激腸道反應(yīng)敏感提供有力的證據(jù)。

現(xiàn)有研究表明[6]，在門的水平上正常人類腸道常見的菌門包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門、放線菌門、疣微菌門等，分別占到了總數(shù)的57.81%、35.74%、2.69%、1.9%、0.87%、0.26%，且厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，占腸道菌群的93.55%。同樣，發(fā)現(xiàn)WHBE兔和JW兔腸道中最常見的有7種菌門依次為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、疣微菌門、軟壁菌門、藍(lán)菌門、放線菌門，其中厚壁菌門、擬桿菌門為兔腸道優(yōu)勢(shì)菌群，分別占腸道菌群的94.93%和96.20%，可見WHBE兔的優(yōu)勢(shì)菌群與人類腸道菌群最為接近。研究發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下WHBE兔厚壁菌門比例明顯低于JW兔，并在IBS模型WHBE兔進(jìn)一步出現(xiàn)下降，同時(shí)擬桿菌門比例明顯升高，這與臨床研究顯示腹瀉型IBS患者直腸粘膜存在厚壁菌門比例出現(xiàn)下降和擬桿菌門比例顯著升高相一致[7]；并發(fā)現(xiàn)擬桿菌的增加可促進(jìn)過(guò)度發(fā)酵，引起腸道脹氣增多，發(fā)生腹脹、不適等IBS癥狀[8]，這與本研究發(fā)現(xiàn)WHBE兔IBS模型腹圍指數(shù)明顯增加相一致，同時(shí)WHBE兔IBS模型中還存在疣微菌門和綠彎菌門比例的下降。但JW兔IBS模型中各菌門總體豐度變化差異不明顯，提示IBS模型WHBE兔腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)容易發(fā)生明顯改變，導(dǎo)致菌群多樣性降低，是導(dǎo)致IBS易感的原因之一。近來(lái)發(fā)現(xiàn)腸道菌群在調(diào)控大腦活動(dòng)和情緒方面起著重要的作用，并可通過(guò)免疫-神經(jīng)遞質(zhì)、HPA軸來(lái)發(fā)揮效應(yīng)[9]，在抑郁癥患者中厚壁菌門豐度降低和擬桿菌門豐度升高[10]，而這與IBS模型中WHBE兔厚壁菌門豐度低、擬桿菌門豐度高十分相似，結(jié)合前期研究證實(shí)WHBE兔IBS模型存在HPA軸紊亂和5-HT水平的升高[11]，并表現(xiàn)出活動(dòng)減少、表情抑郁、結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)功能加快的臨床表征，表明WHBE兔IBS的產(chǎn)生與5-HT分泌增加，增加結(jié)腸的收縮，進(jìn)而加快結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)速度，誘發(fā)IBS有關(guān)，這也符合臨床IBS患者情志改變的特點(diǎn)，說(shuō)明IBS的臨床表現(xiàn)與腸道菌群有關(guān)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， WHBE兔IBS模型厚壁菌門的消化菌科rc4-4菌屬升高，鏈球菌屬降低以及疣微菌門Akk菌屬降低；而rc4-4菌屬被證實(shí)在IBS腸道高敏感大鼠中升高相一致[12]。Akk菌是新一代益生菌，于2004年由Derrien等[13]將其在人體腸道中分離出來(lái)，Akk菌依附腸道黏膜而生，Akk菌可以使用腸道黏膜上的黏蛋白作為其能源，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用保護(hù)腸道免受病原體侵害[14]。Akk菌還可能參與了恢復(fù)腸道黏蛋白儲(chǔ)備的機(jī)制[15]，腸道中Akk菌的下降可能導(dǎo)致黏膜層的變薄，從而導(dǎo)致腸道屏障功能減弱。因此，WHBE兔正常情況下腸道中Akk菌的比例相對(duì)較高，被外界環(huán)境因素干擾后出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，從而打破了原先存在的菌群平衡，導(dǎo)致腸道屏障功能減弱，腹脹明顯，是誘發(fā)IBS的關(guān)鍵菌之一。而在JW兔IBS模型中厚壁菌門的優(yōu)桿菌屬、罕見小球菌屬比例升高，而乳酸桿菌屬、糞桿菌屬和鏈球菌屬比例下降；同樣在IBS患者糞便也存在乳酸桿菌屬、糞球菌屬減少[7]。而且在IBS模型WHBE兔厚壁菌門的消化菌科rc4-4菌屬、糞桿菌屬、梭菌屬均高于JW兔，多爾氏菌屬、糞球菌屬和罕見小球菌屬則低于JW兔。也符合臨床腹瀉型IBS患者糞便中桿菌屬升高，多爾氏菌屬、糞球菌屬和罕見小球菌屬則減少[7]，從這些菌群改變來(lái)看，WHBE兔IBS的程度確實(shí)比JW兔表現(xiàn)更為嚴(yán)重。另外，也發(fā)現(xiàn)WHBE兔和JW兔IBS模型中Parabacteroides菌屬比例均有降低趨勢(shì)，Noor等[16]研究IBS患者及正常人的糞便菌群發(fā)現(xiàn)，正常人Parabacteroides菌屬有較高水平的表達(dá)，推測(cè)Parabacteroides菌屬可能與腸易激綜合征的發(fā)生有關(guān)。此外，從這兩種實(shí)驗(yàn)兔品系來(lái)看，WHBE兔厚壁菌門的優(yōu)桿菌屬、糞桿菌屬、AKK菌屬均高于JW兔，而韋榮球菌屬、鏈球菌屬、顫螺旋菌屬、瘤胃球菌科的Pseudoflavonifractor菌屬則低于JW兔，以及擬桿菌門紫單胞菌科Odoribacter菌屬也低于JW兔，表明這兩種實(shí)驗(yàn)兔的腸道菌群存在明顯的差異，特別是韋榮球菌屬、顫螺旋菌屬、瘤胃球菌屬等菌群均具有產(chǎn)生短鏈脂肪酸的功能，而短鏈脂肪酸能保護(hù)腸道屏障功能，但在WHBE兔腸道中這些菌群均明顯低于JW兔，更有力說(shuō)明WHBE兔易患腸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)性明顯增加。

綜上所述，IBS模型兔存在腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致菌群多樣性降低；WHBE兔和JW兔IBS模型腸道菌群變化均具有其自身特點(diǎn)，且具有明顯的差異性。

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