李天天，何貝貝，李娜，劉婷，時(shí)夢(mèng)，肖英平，楊華，展德文，王軍軍*

(1. 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 北京 100193； 2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021； 3. 斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，北京 102101)

飼料利用效率關(guān)乎動(dòng)物生產(chǎn)效益和節(jié)糧減排等重要問題，同時(shí)也是評(píng)價(jià)動(dòng)物生產(chǎn)性能的常用指標(biāo)，間接表明了動(dòng)物對(duì)能量和蛋白質(zhì)的利用效率。然而在生產(chǎn)中，即使是同一品種、同一批次的豬在飼料利用效率方面也有著很大的變異，這些變異主要源于個(gè)體遺傳背景間的細(xì)微差異、妊娠期或新生期造成的表觀遺傳修飾以及腸道微生物菌群組成變異[1]。其中，腸道微生物被認(rèn)為既在宿主健康中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也影響著飼料的消化以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和能量供應(yīng)[2-3]。因此，腸道微生物組成結(jié)構(gòu)與飼料利用效率間可能存在著特定的關(guān)聯(lián)關(guān)系與影響規(guī)律。

然而，由于腸道菌群組成復(fù)雜、有成熟培養(yǎng)方法的微生物又不到10%[4]，使得逐一研究這些微生物的功能變得不太可能。雖然通過交互共生培養(yǎng)法可以同時(shí)培養(yǎng)并研究多種腸道微生物[5]，但是這種體外培養(yǎng)方法又忽略了腸道菌群在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收及其對(duì)機(jī)體代謝調(diào)控的作用。糞菌移植技術(shù)與無菌動(dòng)物培育技術(shù)的逐漸成熟，為進(jìn)行相關(guān)研究奠定了較好的技術(shù)基礎(chǔ)[6]。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建不同飼料利用效率豬的模型，并將其糞菌移植到經(jīng)混合抗生素處理的偽無菌小鼠體內(nèi)，探討不同飼料利用效率豬的糞便微生物對(duì)偽無菌小鼠生長表型的影響規(guī)律及其可能機(jī)制，以期為從腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)的角度改善豬的飼料利用效率奠定一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

28日齡斷奶的無特定病原菌(SPF)C57BL/6 J小鼠36只來源于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2014-0006】。小鼠飼養(yǎng)在無菌隔離包內(nèi)，自由采食無菌的標(biāo)準(zhǔn)顆粒鼠糧并24 h自由飲水。室內(nèi)溫度保持恒溫23℃，相對(duì)濕度為63%，晝夜12 h循環(huán)燈光。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)及組織取材均于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司設(shè)備內(nèi)進(jìn)行【SYXK(京)2014-0037】。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理相關(guān)規(guī)定。

選取36頭28 kg左右的閹公豬(杜×長×大)為材料，在營養(yǎng)代謝室中進(jìn)行42 d單籠飼養(yǎng)，自由采食飲水。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理相關(guān)規(guī)定。生長豬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在國家飼料工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心豐寧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 不同飼料利用效率生長豬模型的構(gòu)建及樣品采集

選取同一品種(杜×長×大)相近體重(28.31±0.91 kg)的閹公豬36頭，適應(yīng)一周后進(jìn)行42 d單籠飼養(yǎng)，自由采食及飲水。每周以動(dòng)物個(gè)體為單位分別記錄每頭豬的采食量與體重，計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化率以及日增重；實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1周使用全收糞法測(cè)定不同飼料轉(zhuǎn)化效率豬的營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。5 d收集期結(jié)東后, 將5 d的鮮糞樣品以動(dòng)物為單位集中在一起經(jīng)充分混合后，于60～65℃烘干至恒重。樣品干燥后粉碎，過40目篩，裝袋待測(cè)。根據(jù)飼料轉(zhuǎn)化效率和日增重排序(以飼料轉(zhuǎn)化率為主因素并綜合考慮日增重)，從36頭豬中選出飼料利用效率高、中、低的生長豬各6頭，采集挑選出的18頭生長豬新鮮糞便，液氮速凍后放于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 偽無菌小鼠模型的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)采取雌雄分養(yǎng)，每個(gè)籠子6只小鼠，參照Wang等[7]的方法，采用廣譜抗生素處理小鼠以構(gòu)建無菌小鼠模型。具體方法為：在小鼠飲用水中加入0.5 g/L萬古霉素、1 g/L硫酸新霉素、1 g/L甲硝唑和1 g/L氨芐西林，自由口服28 d。參照Pang等[8]的方法，制備移植供體豬的糞便微生物。具體方法為：將豬的新鮮糞便迅速懸浮于預(yù)還原處理過的無菌生理鹽水中(每克糞便加入4 mL生理鹽水，即稀釋5倍)，漩渦混勻1 min，靜置1 min，快速吸取上清，盛于1.5 mL滅菌處理過的離心管中于-20℃保存用于菌群移植。取上述抗生素處理的小鼠，分成3組，每組雌雄各6只，采用灌胃針分別用不同飼料利用效率豬糞便菌懸液進(jìn)行灌胃，每次0.2 mL，連續(xù)灌注7 d。接種后連續(xù)飼養(yǎng) 21 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前稱取每組小鼠的體重及采食量，用于計(jì)算飼料轉(zhuǎn)化率，并取小鼠糞便用于高通量測(cè)序分析。

1.2.3 DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增

用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen 公司)試劑盒抽提不同飼料利用效率生長豬和受體小鼠的糞便總基因組DNA。采用引物：3′-TAC GGR AGG CAG CAG-5′和5′-AGG GTA TCT AAT CCT-3′對(duì)豬糞便16S rRNA 基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序由北京計(jì)算中心完成。采用引物3′-CCTACGGGAG GCAGCAG-5′和5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′對(duì)小鼠糞便16S rRNA 基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序由上海銳翌生物科技有限公司完成。16S rRNA 基因 V3-V4 區(qū)的測(cè)序均采用 Illumina Hiseq 高通量測(cè)序平臺(tái)。

1.2.4 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測(cè)定

總能測(cè)定按照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO9831∶1998推薦方法，使用氧彈式測(cè)熱儀(Parr Instruments，Moline，IL)測(cè)定；使用GB/T6435—1986方法測(cè)定糞樣的干物質(zhì)含量；糞樣中粗蛋白的含量依照AOAC(1990)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定；中性洗滌纖維(NDF)依照BG/T 20806-2006的方法測(cè)定；酸性洗滌纖維(ADF)依照BG/T 20805-2006的方法測(cè)定。某種營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率=100% - 糞樣中某養(yǎng)分含量/飼料中某養(yǎng)分含量×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同飼料利用效率的生長豬模型建立

用全程飼料轉(zhuǎn)化率(feed conversion ratio, FCR)排序，F(xiàn)CR越低，表示飼料利用效率越高，反之亦然。以FCR為主，剔除日增重過小的豬只，分為高飼料利用效率豬(HP)、中飼料利用效率豬(MP)和低飼料利用效率豬(LP)三組，每組6只。分組后高、低飼料利用效率組的FCR差異有顯著性(P<0.05)。

2.2 接受不同飼料利用效率豬糞便移植后受體小鼠的生長性能

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一周移植高飼料利用效率豬糞便菌群的小鼠日增重和飼料利用效率顯著高于移植低飼料利用效率豬糞便菌群的小鼠，表明糞菌移植導(dǎo)致了生長性能表型的再現(xiàn)，即：高飼料利用效率受體小鼠的周增重與料重比都顯著優(yōu)于低飼料利用效率的受體小鼠。見表1

2.3 不同飼料利用效率豬的腸道微生物結(jié)構(gòu)分析

通過對(duì)供體豬糞便微生物高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)高飼料利用率組代表豐度的ACE指數(shù)和Chao 1指數(shù)及代表多樣性的辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)都顯著高于低飼料利用效率組，可知高飼料利用效率豬糞便中微生物的物種豐富度和多樣性明顯高于低飼料利用效率豬，見表2。對(duì)從不同飼料利用效率豬的糞便樣品中獲得的OTU(操作分類單位，operational taxonomic units)在屬水平上進(jìn)行物種注釋，如圖1所示，高飼料利用率組的生長豬糞便中擬桿菌屬(Bacteroides)比例比低飼料利用效率豬低5.7%(P<0.05)，擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)豐度比低飼料利用效率豬低4.2%(P<0.05)，密螺旋體屬(Treponema)豐度比低飼料利用效率豬低6.9%(P<0.05)，而產(chǎn)氣短桿菌(Methanobrevibacter)豐度則顯著高于低飼料利用效率豬(P<0.05)。

2.4 接受不同飼料利用效率豬糞便移植后受體小鼠的糞便微生物結(jié)構(gòu)分析

通過對(duì)受體小鼠糞便微生物高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)高飼料利用率組辛普森指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)顯著高于低飼料利用效率組，可見受體小鼠的微生物豐富度和多樣性受到了供體豬的定向改變。而且，移植高、低飼料利用效率糞便的兩組小鼠腸道菌群差異明顯。如圖2所示，高飼料利用效率受體小鼠的腸球菌(Enterococcus)和阿克曼氏菌(Akkermansia)比例顯著高于低飼料利用效率受體小鼠，分別為8.7%(P<0.001)和6.5%(P<0.05)。而Lactobacillus則為低飼料利用效率受體小鼠優(yōu)勢(shì)菌群，占61.6%，遠(yuǎn)高于高飼料利用效率受體小鼠的14.5%(P<0.001)。

2.5 不同飼料利用效率豬的營養(yǎng)物質(zhì)消化率

不同飼料利用效率豬營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率結(jié)果見表3。由表3可以看出，HP組總能表觀消化率顯著高于LP組(P=0.01)，而干物質(zhì)和粗蛋白消化率統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(P>0.05)。與此同時(shí)，HP組的中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的表觀消化率也顯著高于LP組(P<0.05)，表明HP組總能的提高與纖維的消化率提高呈正相關(guān)，提示腸道微生物可能在纖維降解功能發(fā)揮了一定的作用。

表1 不同飼料利用效率受體鼠的生長性能Tab.1 Growth performance of recipient mice with different feed efficiency

表2 不同飼料利用效率豬糞便微生物的物種豐富度和微生物多樣性Tab.2 Microbial species richness and diversity of pigs with different feed efficiency

圖1 高低飼料利用效率生長豬的糞便微生物組成差異Fig.1 Fecal microbiota composition of pigs with different feed efficiency at genus level

圖2 高低飼料利用效率受體小鼠的糞便微生物組成差異Fig.2 Fecal microbiota composition of recipient mice at genus level

組別Groups干物質(zhì)Drymatter總能Grossenergy粗蛋白Crudeprotein中性洗滌纖維Neutraldetergentfiber酸性洗滌纖維Aciddetergentfiber粗纖維Crudefiber低飼料利用效率豬LP84.9583.4377.6447.9556.9578.42中飼料利用效率豬MP85.3384.5278.4550.9457.6378.05高飼料利用效率豬HP86.0286.1579.6054.0660.9879.60均值標(biāo)準(zhǔn)誤SEM0.550.611.831.911.672.14P值P-value0.220.010.34<0.05<0.050.71

3 討論

本研究通過構(gòu)建不同飼料利用效率豬的模型，挑選出不同飼料利用效率豬的糞便進(jìn)行糞菌移植，受體偽無菌小鼠在移植后三周重現(xiàn)了其對(duì)應(yīng)供體豬的生長性能和飼料利用效率表型。并初步從豬和小鼠的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)、不同飼料利用效率豬養(yǎng)分消化率及其與腸道微生物關(guān)系的角度對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行了探討。

之前的研究表明：不同品種豬糞便微生物的差異特性，可經(jīng)糞菌移植向無菌小鼠部分轉(zhuǎn)移，特別是腸道形態(tài)和酶活，都和供體豬一致[9]。如Yan等[10]發(fā)現(xiàn)與瘦肉型豬(約克夏)和其對(duì)應(yīng)受體無菌小鼠相比，地方豬種(榮昌豬)和其對(duì)應(yīng)的受體無菌小鼠有著較高的體脂、慢肌纖維比例并增強(qiáng)了腓腸肌的脂肪生成作用。而這些差異都被認(rèn)為是腸道微生物發(fā)揮了主要作用。本實(shí)驗(yàn)中，受體小鼠定向重現(xiàn)了供體豬的生長表型，即接受高飼料利用效率豬糞便移植的受體小鼠在采食量、日增重及飼料利用率方面都高于接受低飼料利用效率豬糞便移植的受體小鼠。這與前期大量的人-鼠糞菌移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，即腸道微生物移植具有表型重現(xiàn)的介導(dǎo)作用[11-12]。

移植不同飼料利用效率豬的糞便在定向改變受體小鼠生長性能的同時(shí)，也定向改變了受體小鼠的微生物豐富度和多樣性。香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)用來解釋微生物菌種的多樣性，其值越高表明腸道微生物組成越復(fù)雜，菌種之間的相互依賴和制衡能力越強(qiáng)，表示菌群在有外界環(huán)境波動(dòng)或遭受應(yīng)激刺激時(shí)能更好的應(yīng)對(duì)不良因素對(duì)機(jī)體造成的負(fù)面影響，從而起到緩解機(jī)體應(yīng)激的作用[13-15]。本研究中，高飼料利用效率豬及其受體小鼠的微生物豐富度和多樣性都顯著高于低飼料利用效率的豬及其受體小鼠，表明其在養(yǎng)殖環(huán)境下抗應(yīng)激和不良因素的能力較強(qiáng)，對(duì)于其提高飼料利用效率有促進(jìn)作用。此外，在雞的研究也表明不同飼料轉(zhuǎn)化率雞空腸和盲腸的菌群存在差異，飼料轉(zhuǎn)化率高的雞盲腸菌群豐富度和多樣性較高，并且推斷可能會(huì)影響動(dòng)物的生長性能[1]。

高飼料利用效率豬的總能消化率顯著高于低飼料利用效率豬(P<0.05)，且總能消化率的提升主要來源于纖維(NDF和ADF)的消化率提升與供能。由于纖維類物質(zhì)不被小腸消化，進(jìn)入大腸后主要由大腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，可提供機(jī)體10%～15% 的維持凈能[2]，所以腸道微生物對(duì)纖維消化率的貢獻(xiàn)至關(guān)重要。通過分析不同飼料利用效率豬的腸道微生物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)氣短桿菌，作為一種利用乙酸的甲烷菌，其在高飼料利用效率豬腸道中的豐度顯著高于低飼料利用效率的豬，前期研究發(fā)現(xiàn)在瘦肉型豬中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量較高，且與較高的纖維消化率直接相關(guān)[16-18]，表明其提高了高飼料利用效率豬的纖維利用率。而當(dāng)糞菌移植到受體偽無菌小鼠后，移植了高飼料利用效率豬糞菌的受體鼠其腸球菌豐度顯著高于低飼料利用效率的受體鼠，這與之前的研究相符，即在日糧中添加腸球菌有助于提高生長性能，并降低腹瀉發(fā)生率[19-20]。同時(shí)，高飼料利用效率受體鼠的阿克曼氏菌含量顯著高于低飼料利用效率受體鼠，研究發(fā)現(xiàn)阿克曼氏菌有助于代謝健康，葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)以及預(yù)防腸道炎癥，并發(fā)現(xiàn)在肥胖人群中含量低于正常人群，提示其調(diào)節(jié)脂肪代謝的作用[21-23]；這表明高飼料利用效率受體鼠的腸道健康和代謝狀況較好，且較少轉(zhuǎn)化能量為脂肪，從而提高了能量的利用效率。值得注意的是，低飼料利用效率受體鼠的乳酸菌含量遠(yuǎn)超高飼料利用效率的受體鼠，但是其過高的含量大大降低了其微生物多樣性，不利于動(dòng)物的生產(chǎn)性能，雖然大量研究表明乳酸菌可以促進(jìn)免疫系統(tǒng)成熟和腸道健康[24]，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能[25-26]；但是雙盲實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在健康人群中添加乳酸菌基本沒有效果[27]，表明在潔凈環(huán)境中乳酸菌對(duì)生產(chǎn)性能可能沒有幫助。

總之，本研究在構(gòu)建不同飼料利用效率豬模型的基礎(chǔ)上，通過糞菌移植在偽無菌小鼠中成功重現(xiàn)了供體豬的微生物組成結(jié)構(gòu)、生長性能表型，驗(yàn)證了腸道微生物在營養(yǎng)物質(zhì)利用和機(jī)體代謝中起重要調(diào)節(jié)作用的科學(xué)假設(shè)，并初步揭示了腸道微生物組成與能量消化率、生長性能間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，為生產(chǎn)實(shí)踐中從腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)的角度改善豬群的整體飼料利用效率奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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