吳 健，張賀賀，楊燕川，陳 湜，楊建全，王 波，陳家驊

(福建農(nóng)林大學(xué) 益蟲研究所，福建 福州 350002)

桔小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)可危害40多個(gè)科的多種水果和蔬菜，是一種世界危害性害蟲。目前，桔小實(shí)蠅的防治采取綜合防治的方法，主要包括引誘劑、蛋白餌劑、生物防治和不育雄蟲等手段[1-2]，以達(dá)到控制桔小實(shí)蠅數(shù)量的目的。其中行為調(diào)控技術(shù)的開發(fā)和利用在桔小實(shí)蠅綜合防治中起著重要的作用[3]，而對其氣味結(jié)合蛋白基因的研究，將有助于我們對桔小實(shí)蠅的防控。

氣味結(jié)合蛋白(odorent binding proteins，OBPs)在昆蟲的生理和行為方面起著重要的作用[4]，是昆蟲識別外界環(huán)境的第一步生化反應(yīng)[5]。大部分OBP的保守結(jié)構(gòu)域都具有6個(gè)高度保守的半胱氨酸位點(diǎn)，但還有一類非典型的OBP，其擁有多于或少于6個(gè)的半胱氨酸位點(diǎn)。因此，根據(jù)保守的半胱氨酸位點(diǎn)個(gè)數(shù)，可以將OBP分為“Classic”、“Dimer”、“Minus-C”、“Plus-C”、“Atypical”五大類[7]。其中“Minus-C”O(jiān)BP缺少C2和C5兩個(gè)半胱氨酸[8-9]。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，OBP基因的研究逐漸增多，OBP蛋白可以選擇性結(jié)合配基氣味分子的研究已經(jīng)在很多昆蟲中完成。如鱗翅目中的小菜蛾P(guān)lutellaxylostella[7]、膜翅目中的中華蜜蜂ApisceranaceranaFabricius[10]、半翅目中的綠盲蝽Apolyguslucorum[11]、雙翅目中的岡比亞按蚊Anophelesgambiae[12]等。在雙翅目昆蟲中，OBP基因的研究雖然比較多，但大量的研究僅僅停留在基因的鑒定和表達(dá)分析上，關(guān)于蛋白結(jié)構(gòu)、結(jié)合特征和功能上的研究卻很少，特別是“Minus-C”O(jiān)BP的研究甚少，目前已報(bào)道的有棗實(shí)蠅CarpomyavesuvianaCosta CvcoOBP2和CvcoOBP5[13]，二化螟ChilosuppressalisCsupOBP1[14]，棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHubner HarmOBP17和HarmOBP18[15]等。據(jù)報(bào)道，“Minus-C”O(jiān)BP氨基酸序列排列方式通常是Xn-C1-X30-C2-X39-C3-X16-C4-Xn(X可代表任意氨基酸)[16]，在其三維結(jié)構(gòu)的研究中，最先被報(bào)道的是西方蜜蜂ApismelliferaLinnaeus AmelOBP14[17]，隨后其他昆蟲的“Minus-C”O(jiān)BP的三維結(jié)構(gòu)也有報(bào)道，如云斑天牛BhorOBPm2[18]。

桔小實(shí)蠅OBP的研究同樣比較少，其中大部分也僅對桔小實(shí)蠅OBP基因進(jìn)行了鑒定和表達(dá)譜分析[19-22]，共發(fā)現(xiàn)7種Minus-COBP基因，根據(jù)其組織表達(dá)分析可知“Minus-C”O(jiān)BP在腹部大量表達(dá)或在所有組織中微量表達(dá)。而Chen等[23]只對一個(gè)普通氣味結(jié)合蛋白進(jìn)行了功能分析，“Minus-C” OBP的結(jié)合特征和功能研究在桔小實(shí)蠅中沒有被報(bào)道。而OBP的結(jié)合特征有助于桔小實(shí)蠅引誘物的篩選，從而配制出具有良好引誘作用的誘劑。因此，在前人的基礎(chǔ)上對桔小實(shí)蠅的一個(gè)“Minus-C”O(jiān)BP基因進(jìn)行了克隆、體外原核表達(dá)和不同寄主植物揮發(fā)物的結(jié)合能力測定，對其結(jié)合能力進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)蟲源

實(shí)驗(yàn)昆蟲為福建農(nóng)林大學(xué)益蟲研究所所飼養(yǎng)的桔小實(shí)蠅(敏感品系)。幼蟲與成蟲都用實(shí)驗(yàn)室研制的人工飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度(22±1)℃，光周期14L∶10D，濕度60%～70%。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit，DNA膠回收試劑盒EasyPure?Quick Gel Extraction Kit，質(zhì)粒提取試劑盒TransTaq?HiFi DNA polymerase，pEASY?-T1 Clone Vector，BL21(DE3)均購自北京全式金；限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI購自TaKaRa；引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成；熒光探針N-phenyl-1-naphthylamine(簡稱1-NPN)購自福州都拜特生物技術(shù)有限公司；寄主植物揮發(fā)物如表1所示，均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank上桔小實(shí)蠅OBP1序列(登錄號為KC559112)，利用Primer Premire 5.0設(shè)計(jì)引物OBP1-F、OBP1-R(表2)，并送自到鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

1.4 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

取桔小實(shí)蠅雌雄蟲各一只(羽化15 d，不考慮其交配情況)，在液氮中用研磨棒反復(fù)研磨后，用RNAprep Pure Tissue Kit提取總RNA。cDNA的合成參照cDNA Synthesis SuperMix說明書進(jìn)行。第一鏈cDNA合成后分管保存于-20 ℃冰箱或用于下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 候選配基

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.5 桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的克隆、序列分析和進(jìn)化樹構(gòu)建

以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得桔小實(shí)蠅OBP1a基因序列。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。電泳膠回收后連接至pEASY?-T1 載體上，并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)培養(yǎng)后，挑單克隆菌進(jìn)行菌液PCR檢驗(yàn)，最后將驗(yàn)證正確的菌液送至鉑尚生物公司測序。

利用在線軟件Expasy(http://web.expasy.org/translate/)和(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白翻譯、ORF預(yù)測和理化性質(zhì)分析；利用SignalP 4.1在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號肽預(yù)測；利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)工具進(jìn)行序列相似性搜索，并利用MEGA5.0軟件中的最小進(jìn)化法(1 000次抽樣分析)構(gòu)建基于氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)序列分析結(jié)果設(shè)計(jì)去信號肽引物OBP1ds-F、OBP1ds-R(表2)，并在引物上下游加上酶切位點(diǎn)NcoI和XhoI(下劃線表示)，利用PCR擴(kuò)增獲得去信號肽序列，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。電泳膠回收，測濃度后連接至pEASY?-T1 載體上，并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單克隆菌進(jìn)行菌液PCR檢驗(yàn)，最后將檢驗(yàn)正確的菌液送至鉑尚生物公司測序，并返還質(zhì)粒。將測序正確的質(zhì)粒與pET28a載體分別經(jīng)NcoI和XhoI酶切，之后用T4DNA連接酶連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。過夜培養(yǎng)后，挑取陽性克隆菌落，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證成功后用于原核表達(dá)。

1.7 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化和純化

將克隆菌接種到含卡那霉素(kanamycin)的LB液體培養(yǎng)基(工作濃度為50 μg/mL)中，37 ℃過夜培養(yǎng)。次日，按1∶100的比例，將活化菌接種到10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)2～3 h至OD600=0.6時(shí)，添加IPTG至終濃度0.1,0.3,0.5,0.7,0.9 mmol/L，8 h后收集菌體；0.5 mmol/L IPTG濃度下接種活化菌，于0,2,4,6,8 h收集1 mL菌體，共5管；0.5 mmol/L IPTG濃度下接種活化菌，在30 ℃條件下誘導(dǎo)6 h。將收集的菌液用PBS溶液懸浮，加溶菌酶(工作濃度為250 mg/mL)過夜溶解，再經(jīng)超聲波(200 W,持續(xù)5 s，間隔5 s)破碎20 min。12 000 r/min離心20 min分別收集包涵體和上清。最后，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳確定其表達(dá)形式，若目的蛋白在上清中，可直接用于純化，反之則需要對包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性處理。純化：將蛋白液離心后，過鎳柱，使目的蛋白吸附到柱子上，用不同濃度的咪唑(20，40，80，150，200，300，400 mmol/L)洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，經(jīng)SDS檢測后，用透析袋對含有目的蛋白的洗脫液進(jìn)行過夜透析。

1.8 桔小實(shí)蠅OBP1重組蛋白的配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)

BdorOBP1a蛋白與1-NPN的結(jié)合曲線測定：取2 mL(用50 mmol/L Tris緩沖液稀釋至2 μmol/L)蛋白溶液于熒光比色皿中，依次添加1-NPN溶液(甲醇溶解)，使其濃度從2～20 μmol/L依次遞增，每次反應(yīng)時(shí)間為2 min，記錄在337 nm激發(fā)波長下的熒光值，重復(fù)3次，并計(jì)算出該蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)共選取了21種寄主植物揮發(fā)物，用甲醇溶液將其稀釋到2 mmol/L。在配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，向比色皿中加入蛋白與1-NPN的混合溶液(終濃度均為2 μmol/L)，靜止2 min，使其充分反應(yīng)，測定其在337 nm激發(fā)波長下的熒光值，然后揮發(fā)物依次添加到比色皿中，使其濃度從2～16 μmol/L依次遞增，每次反應(yīng)時(shí)間為2 min，記錄熒光值，對于熒光值有明顯下降趨勢的氣味標(biāo)樣，再進(jìn)行2次重復(fù)測定。根據(jù)公式計(jì)算配基的解離常數(shù)Ki(Ki=IC50/[1+(1-NPN)/K1-NPN])，其中IC50為配基替換50%探針時(shí)的濃度，(1-NPN)為未結(jié)合1-NPN濃度，K1-NPN為OBP與1-NPN復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)[24]。

1.9 桔小實(shí)蠅對揮發(fā)物的行為反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)選取結(jié)合能力較好的揮發(fā)物進(jìn)行測試，用甲醇將其稀釋到100 μmol/L。測試小籠(30 cm×30 cm×30 cm不銹鋼骨架加100目尼龍網(wǎng))中放入40頭性成熟的成蟲(已饑餓處理、雌雄比為1∶1)，其上放一含水的海綿，每籠放置兩個(gè)誘集瓶，分別添加樣品和對照(甲醇溶液)各1 mL，測試時(shí)間為24 h，統(tǒng)計(jì)誘集瓶中實(shí)蠅的數(shù)量，重復(fù)3次。

1.10 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件中的單因數(shù)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

以第一鏈cDNA為模板，擴(kuò)增得到一條特異性條帶，測序結(jié)果表明該片段大小為480 bp。通過序列對比發(fā)現(xiàn)與GenBank上的基因序列(登錄號：KC559112)相似性為98%。蛋白序列相似性為99%，有兩個(gè)氨基酸不同。

BdorOBP1a開放閱讀框(open reading frame，ORF)長480 bp，編碼159個(gè)氨基酸，具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基(圖1)，是一個(gè)Minus-COBP基因，缺少C2、C5兩個(gè)保守的半胱氨酸。BdorOBP1a的預(yù)測分子量為18.77 ku，等電點(diǎn)為5.68，成熟肽的分子量為16.9 ku。

下劃線表示為信號肽序列，方框內(nèi)表示為保守的半胱氨酸，星號表示為終止密碼子，著重號表示為變異的氨基酸 The predicted signal peptide sequence is underlined，conserved cysteines are boxed，stop codon is indicated with an asteriskand mutant amino acids are indicated with bullets.圖1 桔小實(shí)蠅BdorOBP1a基因的核酸及氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of the BdorOBP1a gene of Bactrocera dorsalis

圖2 BdorOBP1a與其它昆蟲Minus-C OBPs序列對比Fig.2 Alignment of BdorOBP1a with Minus-C OBPs from other insects

OBPs序列來源,BdorOBP1：桔小實(shí)蠅，雙翅目；BlatOBP99a：辣椒實(shí)蠅，雙翅目；BoleOBP99a：橄欖果蠅，雙翅目；ZcucOBP99a：瓜實(shí)蠅，雙翅目；ZtauOBP99a：南亞實(shí)蠅，雙翅目；CcapOBP99a：地中海實(shí)蠅，雙翅目；CvesOBP2：棗實(shí)蠅，雙翅目；RzepOBP99ax1：蘋果實(shí)蠅，雙翅目；RzepOBP99ax2：蘋果實(shí)蠅，雙翅目；AfraOBP8a：按實(shí)蠅，雙翅目；AoblOBP8a：西印度按實(shí)蠅，雙翅目；ScalOBP99b：廄螫蠅，雙翅目；MdomOBP99b：家蠅，雙翅目；GmorOBP22：刺舌蠅，雙翅目；CstyOBP：幽暗麗蠅，雙翅目；DplaOBP20：灰地種蠅，雙翅目；DwilOBP8a：魏氏果蠅，雙翅目；DpseOBP8a：擬暗果蠅，雙翅目；DyakOBP8a：亞庫巴果蠅，雙翅目；DsimOBP8a：擬果蠅，雙翅目。各序列名稱后為序列的GenBank登陸號,本實(shí)驗(yàn)克隆OBP用實(shí)心三角標(biāo)出The origin of OBPs sequence,BdorOBP1：Bactrocera dorsalis，Dpitera；BlatOBP99a：Bactrocera latifrons，Dpitera；BoleOBP99a：Bactrocera oleae，Dpitera；ZcucOBP99a：Bactrocera cucurbitae，Dpitera；ZtauOBP99a：Zeugodacus tau，Dpitera；CcapOBP99a：Ceratitis capitata，Dpitera；CvesOBP2：Carpomay vesuviana，Dpitera；RzepOBP99ax1：Rhagoletis zephyria，Dpitera；RzepOBP99ax2：Rhagoletis zephyria，Dpitera；AfraOBP8a：Anastrepha fraterculus，Dpitera；AoblOBP8a：Anastrepha obliqua，Dpitera；ScalOBP99b：Stomoxys calcitrans，Dpitera；MdomOBP99b：Musca domestica，Dpitera；GmorOBP22：Glossina morsitans，Dpitera；CstyOBP：Calliphora stygia，Dpitera；DplaOBP20：Delia platura，Dpitera；DwilOBP8a：Drosophila willistoni，Dpitera；DpseOBP8a：Drosophila pseudoobscura，Dpitera；DyakOBP8a：Drosophila yakuba，Dpitera；DsimOBP8a：Drosophila simulans，Dpitera.The GenBank accession numbers are listed after the sequence names,the cloned OBP in this table is highlighted with a solid triangle圖3 基于氨基酸序列構(gòu)建的Minus-C OBPs的進(jìn)化樹(最小進(jìn)化法)Fig.3 Minmum-Evolution Tree of Minus-C OBPs based on amino acid sequences

2.2 BdorOBP1a氨基酸序列的比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析

對BdorOBP1a序列進(jìn)行序列相似性搜索，與其他21個(gè)氨基酸序列進(jìn)行對比(圖2)表明，所有序列都具有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，氨基酸序列一致性在33%～96%。序列一致性最高的是辣椒實(shí)蠅BactroceralatifronsBlatOBP99a(GenBank登錄號：LOC108972842)，最低的是擬果蠅DrosophilasimulansDsimOBP8a(GenBank登錄號：KMZ08930)和亞庫巴果蠅DrosophilayakubaDyakOBP8a(GenBank登錄號：XM_002101474)。

采用MEGA的最小進(jìn)化法對雙翅目2個(gè)科20種昆蟲的20個(gè)Minus-C OBP構(gòu)建的進(jìn)化樹表明(圖3)，桔小實(shí)蠅與同科的15種昆蟲聚為一類，分別為辣椒實(shí)蠅、橄欖果蠅、瓜實(shí)蠅、南亞實(shí)蠅、地中海實(shí)蠅、棗實(shí)蠅、蘋果實(shí)蠅、按實(shí)蠅、西印度按實(shí)蠅、廄螫蠅、家蠅、刺舌蠅、幽暗麗蠅、灰地種蠅，剩余4中昆蟲聚為另一類，分別為魏氏果蠅、擬暗果蠅、亞庫巴果蠅、擬果蠅。

2.3 pET-OBP1重組蛋白的表達(dá)及純化

不同IPTG濃度的誘導(dǎo)結(jié)果[圖4(A)：1-6泳道]表明，BdorOBP1a的表達(dá)不隨IPTG濃度的變化而改變；不同時(shí)間的誘導(dǎo)結(jié)果[圖4(B)：7-11泳道]表明，4 h或6 h的誘導(dǎo)表達(dá)量最高；不同溫度的表達(dá)結(jié)果[圖4(C)：12-14泳道]顯示，30 ℃條件下的表達(dá)量高于37 ℃。重組蛋白表達(dá)模式結(jié)果[圖5(A)：1-2泳道]顯示，目的蛋白主要集中在包涵體中。蛋白純化結(jié)果[圖5(B)：3-11泳道]顯示，目的蛋白在120 mmol/L咪唑洗液下，洗脫情況最佳。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～6：IPTG濃度分別為0.9，0.7，0.5，0.3，0.1,0 mmol/L的表達(dá)產(chǎn)物；7～11：分別為IPTG誘導(dǎo)0，2，4，6和8h的表達(dá)產(chǎn)物；12：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物；13～14：分別為30和37 ℃下的表達(dá)產(chǎn)物M：Protein molecular weight marker；1-6：Expression products included by 0.9，0.7，0.5，0.3，0.1and 0 mmol/L of IPTG，respectively；7-11：Expression products included by IPTG for 0，2，4，6 and 8h，respectively；12：Expression products non-induced by IPTG；13-14：Expression products included by IPTG at 30 and 37℃，respectively圖4 重組桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白BdorOBP1a誘導(dǎo)表達(dá)IPTG濃度(A)、誘導(dǎo)時(shí)間(B)和誘導(dǎo)溫度(C)的優(yōu)化Fig.4 Optimization of IPTG concentration(A)，induction time(B)and induction temperature(C)in induced expression of the recombinant BdorOBP1a

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：分別為pET-BdorOBP1a的上清與包涵體；3～5：分別為樣品原液，流出液和洗滌液；6～11：分別為40，80，120，160，200，300 mmol/L咪唑梯度洗脫目的蛋白M：Protein molecular weight marker；1-2：supernatant and sediment of pET-BdorOBP1a；3-5：original sample liquid，effluent and wash buffer of pET-BdorOBP1a；6-11：Taget protein eluted with 40，80，120，160，200，300 mmol/L圖5 重組桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白BdorOBP1a表達(dá)形式的確定及純化Fig.5 Determination the forms of expression and purification of the recombinant BdorOBP1a

2.4 BdorOBP1a與不同氣味分子結(jié)合能力分析

圖6 1-NPN與BdorOBP1a的結(jié)合曲線Fig.6 Bound curve of 1-NPN to BdorOBP1a

根據(jù)Scachard方程將1-NPN與BdorOBP1a的結(jié)合曲線線性化，得到1-NPN與BdorOBP1a的結(jié)合常數(shù)為19.8μmol/L(圖6)。熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定了BdorOBP1a與21種揮發(fā)性氣味的結(jié)合能力，結(jié)果顯示(圖7和表3),在所測的揮發(fā)物中，有15種揮發(fā)物與BdorOBP1a有結(jié)合能力，其中β-紫羅蘭酮和苯甲醛的結(jié)合能力最強(qiáng)，解離常數(shù)分別為31.1和31.8 μmol/L；其次是己酸乙酯和乙酸異戊酯，解離常數(shù)分別為45.3和47 μmol/L；與其他揮發(fā)物結(jié)合的解離常數(shù)均高于50 μmol/L。

圖7 配基與1-NPN競爭結(jié)合重組蛋白BdorOBP1aFig.7 Competitive binding of candidate ligands with 1-NPN to recombinant BdorOBP1a

配體LigandsIC50/(μmol·L-1)Ki/(μmol·L-1)配體LigandsIC50/(μmol·L-1)Ki/(μmol·L-1)乙酸丁酯Butylacetate81．174．4苯甲醛Benzaldehyde34．731．8乙酸己酯Hexylacetate--月桂烯β-Myrcene--丁酸異戊酯Isoamylbutyrate157．3144．3羅勒烯β-Ocimene71．865．8異戊酸異戊酯Isopentylisopentanoate179．7164．8β-紫羅蘭酮β-ionone3431．1己酸異戊酯Isopentylhexanoate--正己醇Hexylalcohol207．7190．5己酸乙酯Ethylcaproate49．445．3苯乙醇2-phenylethanol71．965．9乙酸異丁酯Isobutylacetate159．5146．3芳樟醇Linalool--乙酸葉醇酯leafacetate87．780．4葉醇Leafalcohol145．3133．3乙酸異戊酯Isoamylacetate51．347法尼醇farnesol318．7292．8辛酸甲酯Methyloctanoate--雪松醇Cedrol--己醛Hecanal219．9201．7

2.5 桔小實(shí)蠅行為反應(yīng)測定

桔小實(shí)蠅對4種揮發(fā)物的行為反應(yīng)(圖8)顯示：桔小實(shí)蠅雌蟲(A)對4種揮發(fā)物都表現(xiàn)出顯著差異，其中己酸乙酯、乙酸異戊酯和β-紫羅蘭酮對桔小實(shí)蠅有顯著的引誘作用，而苯甲醛對桔小實(shí)蠅有顯著的趨避作用；桔小實(shí)蠅雄蟲(B)對其中兩種揮發(fā)物表現(xiàn)出顯著差異，分別是己酸乙酯和乙酸異戊酯，對桔小實(shí)蠅有顯著的引誘作用。

A：桔小實(shí)蠅雌蟲；B：桔小實(shí)蠅雄蟲；*樣品與對照間的選擇性顯著差異(P<0.05)A：Bactrocera dorsalis female adults；B：Bactrocera dorsalis male adults；*significant different of choose in samples and control samples(P<0.05)圖8 桔小實(shí)蠅對4種揮發(fā)物的行為反應(yīng)Fig.8 Behavioral responses of Bactrocera dorsalis tofourvolatiles

3 結(jié)論與討論

本研究從桔小實(shí)蠅克隆了一個(gè)非典型的OBP基因BdorOBP1a，其分子特性和氨基酸序列符合OBPs家族的共有特征：分子量小，親水性強(qiáng)和等電點(diǎn)低[25]，表明本實(shí)驗(yàn)克隆的桔小實(shí)蠅BdorOBP1a基因?qū)儆诶ハxOBPs家族成員之一。其編碼的蛋白序列含有26個(gè)氨基酸的信號肽，與NCBI上的蛋白序列有兩個(gè)氨基酸的差異，分別在信號肽和蛋白序列末端，蛋白序列相似性為99%；此外，該基因只含有4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，這與報(bào)道的大多數(shù)昆蟲氣味結(jié)合蛋白特征不一致，屬于“Minus-C”O(jiān)BP，這類OBP報(bào)道的比較少，如二化螟Chilo suppressalis CsupOBP1[14]。BdorOBP1a與其他昆蟲氣味結(jié)合蛋白序列對比和進(jìn)化樹結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)克隆得到的桔小實(shí)蠅BdorOBP1a與GenBank上的BdorOBP1序列位于同一分支上，因此可知這兩個(gè)序列為同源序列，堿基的差異可能是不同的地理環(huán)境或飼料的不同而造成。

為了了解BdorOBP1a的結(jié)合特性，我們利用了原核表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)了目的蛋白，經(jīng)純化柱純化后，用于測定BdorOBP1a與21種揮發(fā)物的結(jié)合能力。測定結(jié)果顯示，有15種寄主植物揮發(fā)物與BdorOBP1a具有一定的結(jié)合能力，如具有較強(qiáng)結(jié)合能力的乙酸異戊酯——成熟香蕉釋放的主要揮發(fā)物，這與桔小實(shí)蠅對成熟香蕉具有較高的趨性而對未成熟的香蕉趨性一般相一致[26]，同時(shí)，乙酸異戊酯在成熟香蕉中的含量是未成熟香蕉的2.2倍，是所有揮發(fā)物中差異最大的[27]，因此推測乙酸異戊酯可能是香蕉引誘桔小實(shí)蠅的特異性物質(zhì)；而乙酸己酯——成熟蘋果的主要揮發(fā)物[28]卻與BdorOBP1a不結(jié)合，這也與桔小實(shí)蠅對蘋果的趨性較差[29]相一致，這表明BdorOBP1a在尋找寄主的過程中起著感受揮發(fā)物和寄主定位的作用。

BdorOBP1a與醇類的結(jié)合能力較弱，而與酯類，醛類和酮類的結(jié)合能力較強(qiáng)，這可能是配基與蛋白的結(jié)合過程受氫鍵，疏水作用，不飽和鍵以及碳原子個(gè)數(shù)[30]影響而造成的。醇類含有羥基，可與水形成氫鍵，從而影響了醇類與氣味結(jié)合蛋白的結(jié)合，而酯類，醛類和酮類都不易溶于水(低級酮除外)，是親酯類化合物，這使其與疏水區(qū)中的疏水性氨基酸結(jié)合位點(diǎn)有較好的結(jié)合能力；此外，蛋白空腔的形狀，位置及氨基酸序列等同樣也會(huì)影響配基與蛋白的結(jié)合。據(jù)報(bào)道，在“Minus-C”O(jiān)BP中，分子體積和疏水性相互作用在結(jié)合中更重要，氫鍵的影響相對較弱些[16]。這從21種揮發(fā)物的結(jié)合特性來看，也有著相似的結(jié)果。

所有揮發(fā)物中結(jié)合能力最強(qiáng)的是β-紫羅蘭酮和苯甲醛，解離常數(shù)分別為31.1、31.8 μmol/L；其次是己酸乙酯和乙酸異戊酯，解離常數(shù)分別為45.3、47 μmol/L。前人的研究表明，配基與蛋白的結(jié)合常數(shù)(Ki值)小于10 μmol/L時(shí)說明具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[31-32]，從表2的Ki值可知，BdorOBP1a與15種揮發(fā)物的結(jié)合常數(shù)都大于30 μmol/L這與GmolOBP3[33]的結(jié)合特性相似，表明所選的配基結(jié)合能力一般，選擇的揮發(fā)物還不夠廣泛，好的配基沒有篩選到。為了弄清它的功能，我們進(jìn)行了行為反應(yīng)測定，表明桔小實(shí)蠅對β-紫羅蘭酮，乙酸異戊酯，苯甲醛和己酸乙酯都具有趨性，這一結(jié)果與配基結(jié)合特性間接說明BdorOBP1a在桔小實(shí)蠅對寄主植物氣味的定位過程中起著重要的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳景蕓,蔡平,張國彪,等.橘小實(shí)蠅發(fā)生與綜合防治研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(5):17324-17326.

Chen J Y,Cai P,Zhang G B,et al.Research progress of occurrence and comprehensive control of oriental fruit fly[J].Journal of AnhuiAgricultural Sciences,2011,39(5):17324-17326.

[2] 梁帆,梁廣勤,趙菊鵬,等.廣州地區(qū)桔小實(shí)蠅的發(fā)生與綜合防治關(guān)鍵措施[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(3):58-61.

Liang F,Liang G Q,Zhao J P,et al.Key methods of occur and comprehensive control to oriental fruit fly in Guangzhou area[J].Guangdong Agricultural Sciences,2008(3):58-61.

[3] 魏佳寧,王憲輝,孫玉誠,等.害蟲的遺傳與行為調(diào)控[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào),2012,49(2):299-308.

Wei J N,Wang X H,Xun Y C,et al.Mechanisms for controlling insects by manipulating their genetics and behavior from gene to ecosystem[J].Chinese Journal of Applied Entomology,2012,49(2):299-308.

[4] Liu N Y,Yang K,Liu Y,et al.Two general-odorant binding proteins inSpodopteralituraare differentially tuned to sex pheromones and plant odorants[J].Comparative Biochemistry & Physiology Part A Molecular & Integrative Physiology,2015,180:23-31.

[5] Feng L,Prestwich G D.Expression and characterization of a lepidopteran general odorant binding protein[J].Insect Biochem Mol Biol,1997,27(5):405-412.

[6] Vogt R G,Callahan F E,Rogers M E,et al.Odorant binding protein diversity and distribution among the insect orders,as indicatedby LAP,an OBP-related protein of the true bugLyguslineolaris(Hemiptera,Heteroptera)[J].Chemical Senses,1999,24(5):481-495.

[7] 程小娟,蔡立君,鄭麗雙,等.小菜蛾氣味結(jié)合蛋白OBP2基因的克隆、表達(dá)譜及其結(jié)合特性分析[J].昆蟲學(xué)報(bào),2016,59(4):365-376.

Cheng X J,Cai L J,Zheng L S,et al.Cloning,expression profiling and binding characterization of the OBP2 gene in the diamondback moth,Plutellaxylostella( Lepidoptera: Plutellidae)[J].Acta Entomologica Sinica,2016,59(4):365-376.

[8] Spinelli S,Lagarde A,Iovinella I,et al.Crystal structure ofApismelliferaOBP14,a C-minus odorant-binding protein,and its complexes with odorant molecules[J].Insect Biochemistry & Molecular Biology,2012,42(1):41.

[9] Li Z Q,Zhang S,Luo J Y,et al.Two Minus-C odorant binding proteins fromHelicoverpaarmigera,display higher ligand binding affinity at acidic pH than neutral pH[J].Journal of Insect Physiology,2013,59(3):263-272.

[10] 吳帆,黃君君,譚靜,等.中華蜜蜂信息素結(jié)合蛋白OBP10的基因克隆、原核表達(dá)和配基結(jié)合特性分析[J].昆蟲學(xué)報(bào),2016,59(1):25-32.

Wu F,Huang J J,Tan J,et al.Molecular cloning,prokaryotic expression and lignand-binding characterization of a novel pheromone binding protein OBP10 inApisceranacerana(Hymenoptera: Apidae)[J].Acta Entomologica Sinica,2016,59(1):25-32.

[11] 朱曉強(qiáng),丁玉驍,劉航瑋,等.綠盲蝽氣味結(jié)合蛋白AlucOBP8的結(jié)合特性分析[J].中國生物防治學(xué)報(bào),2015,31(6):821-829.

Zhu X Q,Din Y X,Liu H W,et al.Binding characterization of the odorant binding proteinsAlucOBP8 inApolyguslucorum[J].Chinese Journal of Biological Control,2015,31(6):821-829.

[12] Biessmann H,Andronopoulou E,Biessmann M R,et al.TheAnophelesgambiaeodorant binding protein 1 (AgamOBP1) mediates indole recognition in the antennae of female mosquitoes[J].Plos One,2010,5(3):e9471.

[13] 李亞偉,張小菊,王科珂,等.棗實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白基因的克隆及表達(dá)譜分析[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,54(2):313-319.

Li Y W,Zhang X J,Wang K K,et al.Clone and expression profiling of odorant-binding proteins inCarpomyavesuvianaCosta[J].Xinjiang Agricultural Sciences,2017,54(2):313-319.

[14] Wei D,Ye Z F,Gao J Q,et al.Molecular cloning and functional identification of a Minus-C odorant binding protein from the rice striped stem borer,Chilosuppressalis(Lepidoptera: Pyralidae).[J].Acta Entomologica Sinica,2013,56(7):754-764.

[15] Li Z Q,Zhang S,Luo J Y,et al.Two Minus-C odorant binding proteins fromHelicoverpaarmigera,display higher ligand binding affinity at acidic pH than neutral pH[J].Journal of Insect Physiology,2013,59(3):263-272.

[16] Li D Z,Yu G Q,Yi S C,et al.Structure-based analysis of the ligand-binding mechanism for DhelOBP21,a C-minus odorant binding protein,fromDastarcushelophoroides(Fairmaire; Coleoptera: Bothrideridae)[J].International Journal of Biological Sciences,2015,11(11):1281-95.

[17] Spinelli S,Lagarde A,Iovinella I,et al.Crystal structure ofApismelliferaOBP14,a C-minus odorant-binding protein,and its complexes with odorant molecules[J].Insect Biochemistry & Molecular Biology,2012,42(1):41-50.

[18] Zheng Z C,Li D Z,Zhou A,et al.Predicted structure of a Minus-C OBP fromBatocerahorsfieldi(Hope) suggests an intermediate structure in evolution of OBPs[J].Scientific Reports,2016,6:33981.

[19] 龔妃良.桔小實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白基因的鑒定與表達(dá)分析[D].廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,2014.

Gong F L.Identification and expression profiling of odorant-binding proteins inBactroceradorsalis[D].Guangzhou：Zhongkai University of Agriculture and Engineering,2014.

[20] Zheng W,Peng W,Zhu C,et al.Identification and expression profile analysis of odorant binding proteins in the oriental fruit fly Bactrocera dorsalis[J].International Journal of Molecular Sciences,2013,14(7):14936-14949.

[21] Liu Z,Smagghe G,Lei Z,et al.Identification of male- and female- specific olfaction genes in antennae of the oriental fruit fly (Bactroceradorsalis)[J].Plos One,2016,11(2):e0147783.

[22] Wu Z,Zhang H,Wang Z,et al.Discovery of chemosensory genes in theoriental fruit fly,Bactroceradorsalis[J].Plos One,2015,10(6):e0129794.

[23] Chen L,Li H L,Zhou Y X,et al.cDNA cloning,tissue expression and ligand binding characteristics of odorant-binding protein 2 from the oriental fruit fly,Bactroceradorsalis(Diptera: Tephritidae)[J].Acta Entomologica Sinica,2013,56(6):612-621.

[24] Zhou J,Zhang N,Wang P,et al.Identification of host-plant volatiles and characterization of two novel general odorant-binding proteins from the legume pod borer,MarucavitrataFabricius (Lepidoptera: Crambidae)[J].Plos One,2015,10(10): e141208.

[25] Pelosi P,Zhou J J,Ban L P,et al.Soluble proteins in insect chemical communication[J].Cellular & Molecular Life Sciences Cmls,2006,63(14):1658-1676.

[26] Armstrong J W.Quarantine security of bananas at harvest maturity against mediterranean and oriental fruit flies (Diptera: Tephritidae) in Hawaii[J].Journal of Economic Entomology,2001,94(1):302.

[27] Shen J M,Zeng L,Hu L M,et al.Comparative analysis of volatile components of banana[J].Journal of Environmental Entomology,2011,33(2):277-281.

[28] Bengtsson M,B?ckman A C,Liblikas I,et al.Plant odor analysis of apple: antennal response of codling moth females to apple volatiles during phenological development[J].J Agric Food Chem,2001,49(8):3736-3741.

[29] 于文惠.桔小實(shí)蠅對幾種寄主果實(shí)的選擇和嗅覺學(xué)習(xí)行為[D].重慶：西南大學(xué),2013.

Yu W H.Host selection and olfactory learning behavior ofBactroceradorsalisto several host fruit[D].Chongqing：Southwest University,2013.

[30] Zhang T,Liu N Y,Dong S L.cDNA cloning,tissue distribution and ligand binding characteristics of antennal binding protein 2 from the beet army worm,Spodopteraexigua(Lepidoptera: Noctuidae)[J].Acta Entomologica Sinica,2012,55(5):499-509.

[31] Guo H,Huang L Q,Pelosi P,et al.Three pheromone-binding proteins help segregation between two Helicoverpa species utilizing the same pheromone components[J].Insect Biochem Mol Biol,2012,42(9):708-16.

[32] Liu N Y,Peng H,Dong S L.Binding properties of pheromone-binding protein 1 from the common cutwormSpodopteralitura[J].Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology,2012,161(4):295.

[33] 宋月芹,解幸承,董鈞鋒,等.梨小食心蟲氣味結(jié)合蛋白GmolOBP3的cDNA克隆、表達(dá)譜及結(jié)合特性分析[J].昆蟲學(xué)報(bào),2014,57(3):274-285.

Song Y Q,Xie X C,Dong J F,et al.cDNA cloning,expression profiling and binding properties of odorant-binding protein GmolOBP3 in the oriental fruit moth,Grapholitamolesta(Lepidoptara: Tortricidae)[J].Acta Entomologica Sinica,2014,57(3):274-285.