張璐璐，譚慧林，張春蘭,2*

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3.新疆阿克蘇地區(qū)食品安全檢測中心，新疆阿克蘇 843000）

蛋白質(zhì)和多糖是食品中的重要組成部分，通過分子相互作用，產(chǎn)生化學(xué)協(xié)同和物理空間協(xié)同，形成食品的高級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而決定食品的質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定和感官，并顯著影響其營養(yǎng)和功能性[1-3]。蛋白質(zhì)與多糖在一定溫度、濕度條件下發(fā)生的美拉德反應(yīng)，會使食品產(chǎn)生特有的色香味，同時美拉德反應(yīng)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)多糖共價復(fù)合物在制備食品級乳液體系中也發(fā)揮著特有的作用。在食品體系中，更為常見的是蛋白質(zhì)與多糖的非共價相互作用，例如靜電相互作用、疏水作用等。蛋白質(zhì)和多糖形成的靜電復(fù)合物、凝膠在功能性成分的保護(hù)、遞送方面，以及Pickering乳液的乳化等方面發(fā)揮巨大潛力[4-8]。帶正電的蛋白質(zhì)與帶負(fù)電荷的多糖形成的靜電復(fù)合物的粒徑大小以及穩(wěn)定性會受到多種因素的影響，例如蛋白質(zhì)與多糖的結(jié)構(gòu)、兩者在食品體系中的混合比例、總濃度、pH值及各種加工條件（如超聲、加熱、剪切等），都會對它們的相互作用產(chǎn)生影響。酪蛋白和果膠是食品中常用的食品添加劑，酪蛋白是牛奶、羊奶中的主要蛋白質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值，故在食品中使用廣泛。果膠一般從柑橘皮、蘋果皮、葡萄皮等植物細(xì)胞中提取，食品中主要是利用其凝膠性生產(chǎn)膠凍、果醬和軟糖，也可用作乳化穩(wěn)定劑和增稠劑。因此本試驗選擇食品中較常用的果膠和酪蛋白為對象，研究食品體系中的pH值、濃度、混合比例以及熱處理對其相互作用的影響。對果膠、酪蛋白相互作用進(jìn)行研究，將對改進(jìn)食品結(jié)構(gòu)、設(shè)計新型食品有重要的實際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PHS-3C型酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

JA5003電子天平，上海箐海儀器有限公司；

HH-501恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；

752紫外可見分光光度計，上海箐海儀器有限公司；

UM-4T系列磁力攪拌器，北京優(yōu)晟聯(lián)合有限公司；

酪蛋白、果膠為阿拉丁試劑有限公司生產(chǎn)；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸疊氮化鈉等均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的配制

1%酪蛋白原液的配制：稱取1.0g酪蛋白倒入燒杯中加入10mL0.1mol/L的NaOH使酪蛋白溶解，加pH為7的10mmol/L磷酸鹽緩沖液至100mL，置于磁力攪拌器上用1500r/min攪拌2h，靜置過夜待用。

1%果膠原液的配制：稱取1.0g果膠溶解在pH為7磷酸鹽緩沖液100mL中,在磁力攪拌器上用1500r/min攪拌2h，靜置過夜待用。

1.2.2 pH對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響

將1%的果膠和酪蛋白分別稀釋成0.2%，以果膠:酪蛋白 =1:1(V:V)調(diào) pH 為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，以蒸餾水為空白，在600nm下測定體系的透光率。然后在85℃恒溫水浴鍋中加熱15min，再在600nm下測定體系的透光率。

1.2.3 濃度對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響

選擇果膠、酪蛋白的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，將兩者以1:1的比例混合，調(diào)節(jié)pH為4.0，以蒸餾水為空白，在600nm下測定體系的透光率。在85℃水浴鍋加熱15min，再在600nm測定體系的透光率。

1.2.4 果膠/酪蛋白的比例對復(fù)合的影響

選擇果膠、酪蛋白的濃度均為0.2%，將果膠:酪蛋白分別以 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3 混合，調(diào)節(jié) pH 為 4.0，以蒸餾水為空白，在600nm下測定體系的透光率。然后在85℃水浴鍋加熱15min，在600nm測定體系的透光率。

1.2.5 加熱溫度對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響

選擇0.2%果膠/酪蛋白1:1混合，調(diào)pH為4.0，在溫度分別為 55℃、65℃、75℃、85℃、95℃水浴加熱 15min，再采用分光光度計，以蒸餾水為空白，在600nm測定體系的透光率。

1.2.6 測定指標(biāo)與方法

根據(jù)測得的透光率按照下式計算濁度。

式中，L為比色皿內(nèi)徑寬度，cm。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響

圖1 不同pH值對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響Fig.1 The effect of pH on pectin/casein complex

從圖1可以看出，體系在pH3.0～4.5加熱后濁度明顯上升，這可能是因為酪蛋白的pI在4.5左右，在pH3.0～4.5時，酪蛋白帶正電，果膠帶負(fù)電，兩者發(fā)生了強(qiáng)烈的靜電相互作用；pH在4.5～8加熱后濁度明顯下降，此時果膠與酪蛋白以共溶的形式存在，具有較高的透明度。相比未加熱的體系，85℃加熱15min后的濁度在pH3.0～5.5范圍內(nèi)均高于未加熱的，這可能是加熱使蛋白質(zhì)變性，進(jìn)一步加劇了酪蛋白與果膠的聚合。因此我們選擇pH在4.0進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

2.2 濃度對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響

從圖2的數(shù)據(jù)中可以看出，隨著濃度的增加，果膠/酪蛋白混合體系的濁度也在不斷上升，表明形成的聚集物也在增加。相比未加熱的體系，果膠/酪蛋白溶液加熱后均有更高的濁度。這主要是由于在較強(qiáng)的靜電相互作用下（pH=4.0）使得果膠與酪蛋白分子強(qiáng)烈結(jié)合，進(jìn)行加熱后更促進(jìn)果膠/酪蛋白形成微凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此加熱過的混合體系比未加熱的濁度要高。而且實驗中還發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度過大時甚至?xí)霈F(xiàn)果膠/酪蛋白的絮凝、沉淀現(xiàn)象。

圖2 不同濃度對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響Fig.2 The effect of concentration on pectin/casein complex

2.3 果膠與酪蛋白的比例對復(fù)合的影響

圖3 不同比例的果膠/酪蛋白對其復(fù)合的影響Fig.3 The effect of ratio on pectin/casein complex

圖3顯示了不同比例的果膠/酪蛋白對其復(fù)合的影響，從圖3中可以看出，在果膠/酪蛋白的比例為1:1時，混合體系的透明度較低，濁度較高。在pH=4.0時，酪蛋白質(zhì)子化后帶正電荷，果膠與酪蛋白在靜電驅(qū)動下形成復(fù)合物。聚集狀態(tài)達(dá)到最佳，聚合物也是最多的時候，所以果膠:酪蛋白=3:1和2:1時，體系的濁度較低，這可能是因為當(dāng)果膠含量多時，負(fù)電荷過多，沒有足夠的酪蛋白與果膠結(jié)合，也可能過多果膠的存在，阻礙了酪蛋白與果膠的聚合；而當(dāng)酪蛋白含量多時，酪蛋白帶正電，與之結(jié)合的果膠不夠，酪蛋白剩余，所以在果膠:酪蛋白=1:3時濁度也較高。

2.4 加熱溫度對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響

熱處理是對蛋白質(zhì)影響較大的處理方法[9]。影響的程度取決于熱處理的時間、溫度以及有無氧化還原性物質(zhì)存在等因素。圖4（見下頁）顯示了溫度對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響，從圖4中可以看出隨溫度的升高，果膠/酪蛋白復(fù)合物的濁度也從0.44/cm增大到0.59/cm，這可能是因為溫度越高，越接近蛋白質(zhì)的變性溫度，使蛋白質(zhì)從天然狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽冃誀顟B(tài)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，產(chǎn)生了聚集。經(jīng)過加熱后，果膠/酪蛋白復(fù)合物形成的作用力除了靜電相互作用外，可能還有氫鍵結(jié)合、共價結(jié)合等作用。

圖4 溫度對果膠/酪蛋白復(fù)合的影響Fig.4 The effect of temperature on pectin/casein complex

2.5 果膠/酪蛋白復(fù)合物表征

使用Nano-ZS粒度儀測定復(fù)合物的粒徑。首先，復(fù)合物用相應(yīng)pH值的磷酸鹽緩沖液稀釋100倍后再測定粒徑，多分散性指數(shù)（Polydispersity Index，PDI），以及乳液電位（ζ-potential）。

2.5.1 pH對果膠/酪蛋白復(fù)合物電位的影響

選擇0.2%的果膠/酪蛋白1:1混合，調(diào)pH在3～8之間，在85℃恒溫水浴鍋加熱15min，再測復(fù)合物的電位，進(jìn)行比較分析。

圖5顯示了果膠/酪蛋白復(fù)合物的電位，在圖中可以看出，隨著pH（3.0～8.0）的增大，果膠/酪蛋白復(fù)合物的電位從-10.2mV降低到-48.6mV。即使是在較低的pH下，復(fù)合物依然帶有負(fù)電，這說明在此條件下酪蛋白的正電荷與果膠的負(fù)電荷發(fā)生了電荷中和，酪蛋白的正電荷全部被果膠的負(fù)電荷所中和。在高pH條件下，酪蛋白與果膠都帶有負(fù)電荷，兩者之間強(qiáng)烈的靜電相斥作用使得酪蛋白與果膠分子以共溶的形式存在。

圖5 果膠/酪蛋白復(fù)合物的電位Fig.5 The charge of pectin/casein complex

2.5.2 pH對果膠/酪蛋白復(fù)合物粒徑、PDI的影響

選擇0.2%的果膠/酪蛋白1:1混合，調(diào)pH在3～8之間，在85℃恒溫水浴鍋加熱15min，再測復(fù)合物的粒徑以及PDI，進(jìn)行比較分析。

圖6 納米粒子的粒徑以及PDIFig.6 The size and PDI of pectin/casein complex

從圖6中看出果膠/酪蛋白復(fù)合物在pH 6.0～8.0時粒徑比較大，約在450nm左右，在此條件下果膠與酪蛋白帶有相同的負(fù)電荷，兩者不能發(fā)生聚集形成小粒徑的納米凝膠。從圖中可以看出在此范圍的PDI值也較大，粒徑分布較分散；而在pH 3.0～5.5范圍內(nèi)粒徑較小，均在300nm以下，其中在pH 5.0時，復(fù)合物的粒徑最小，為162nm。在pH 4.0和4.5時，復(fù)合物的粒徑約240nm，PDI分別為0.19和0.17，說明其粒徑分布較集中。

3 結(jié)論

果膠/酪蛋白在pH 3.0～5.5范圍內(nèi)的濁度均高于未加熱的；隨著濃度（0.1%～0.5%）的增加，果膠/酪蛋白復(fù)合物的濁度增大，當(dāng)濃度過大時會出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象；果膠/酪蛋白為3:1和2:1時，體系的濁度較低，在果膠:酪蛋白=1:1時濁度較高；隨溫度的升高（55～95℃），果膠/酪蛋白復(fù)合物的濁度也從0.44/cm增大到0.59/cm，溫度越高，越接近蛋白質(zhì)的變性溫度，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，產(chǎn)生了聚集。

隨著pH的增大，果膠/酪蛋白復(fù)合物的電位從-10.2mV降低到-48.6mV。果膠/酪蛋白復(fù)合物在pH 6.0～8.0粒徑比較大，約在450nm左右。而在pH 3.0～5.5范圍內(nèi)粒徑較小，均在300nm以下，都是單峰，其粒徑分布較集中，說明形成了納米凝膠。由此可以看出，本文通過對果膠/酪蛋白納米粒子的形成條件進(jìn)行研究，從而達(dá)到對復(fù)合物濁度、粒徑精準(zhǔn)調(diào)控的目的，也為合理控制食品體系中蛋白質(zhì)與多糖的相互作用提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 操義平.多糖/蛋白質(zhì)混合體系復(fù)雜相行為的研究[D].湖北工業(yè)大學(xué),2016.

[2] 許威,李斌.多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體系相轉(zhuǎn)變及其在食品中的應(yīng)用[J].食品科技,2017,42(1):76-80.

[3] 魏冬旭,江連洲,王辰,等.pH值對大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)和表面疏水性的影響[J].食品科學(xué),2015,11:1-5.

[4] 楊飛,王君,藍(lán)強(qiáng),等.Pickering乳狀液的研究進(jìn)展 [J].化學(xué)進(jìn)展,2009,21(7/8):1418-1426.

[5] BAKHTRAMINSHAH.基于殼聚糖納米粒子穩(wěn)定Pickering乳液的制備、表征與姜黃素包埋[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[6] 柴智.納米營養(yǎng)載體中食品多糖與蛋白質(zhì)復(fù)合壁材的協(xié)同穩(wěn)定及控釋[D].中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[7] 孫翠霞,劉夫國,楊偉,等.固體顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑,2015,(04):166-172.

[8] 李海明,楊盛,韋何雯,等.食品級Pickering乳液的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2015,(19):265-270.

[9] 陳振家,施小迪,杜昱蒙,等.不同熱處理大豆分離蛋白凝膠凍藏特性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2016,32(11):283-289.