夏侯秋錦，李 鵬，畢文姬，柏澤新，國 菲

（淄博市公安局刑偵支隊，山東 淄博 255000）

敵敵畏（DDVP），是中毒率和死亡率較高的有機磷農藥之一，常見于投毒事件，自殺事件以及食物誤服中毒事件[1-3]。目前，國內外對敵敵畏的分解動力學研究報告較少，主要集中在敵敵畏的檢測方法及農作物敵敵畏殘留的檢測[4-8]。在敵敵畏中毒案件中，由于送檢不及時或實驗室內部因素往往都會使得檢材不能及時進行檢驗。同時，由于案件的需要，常常要求對所送檢材進行再次、多次檢驗從而確定是否為敵敵畏中毒死亡，毒物會發(fā)生分解，需進行保存檢材中分解動力學研究，明確保存檢材中毒藥物的檢出時限，最佳存儲條件，對于推斷死亡當時或檢材采取當時體內或檢材內毒(藥)物濃度意義重大[9]，而關于敵敵畏的分解動力學研究僅見一篇報告[10]，并且為單一濃度敵敵畏在動物血中的研究，沒有系統全面地分析不同濃度敵敵畏在人血中的分解動力學規(guī)律。本文通過檢測人血中5種不同濃度的敵敵畏在-20、4、20 ℃三種保存條件下含量的變化，更系統、更全面研究敵敵畏在人血檢材中的分解動力學規(guī)律，為敵敵畏中毒案件的法醫(yī)學鑒定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

AB公司4000Q TRAP液質聯用儀、低溫高速離心機、渦旋震蕩器、移液器。

1.1.2 試劑

DDVP標準品（購于公安部物證鑒定中心）、甲醇、乙腈等有機溶劑均為色譜純；試驗用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備：

取5份空白血液，分別添加敵敵畏濃度到0.36、0.72、1.5、3.0、5.3 μg/mL，將每份血再分為 3份，分別置于-20、4、20 ℃三種溫度環(huán)境中，在1、2、4、6、8、12、16、20、24、28、32、40、48、64、80、96、120 d進行檢測。

1.2.2 樣品的處理

1 mL血液中加入2 mL乙腈，高速渦旋振蕩5 min，12 000 r·min-1高速離心7 min，取上清液過0.22μm濾膜過濾，液質聯用儀定性、定量分析。

1.2.3 液相色譜及質譜條件

色譜柱：Waters BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm Column；流速：0.3 mL/min；進樣量：30 μL，流動相A為5 mM乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient setup

質譜：正離子掃描；檢測方式為多反應監(jiān)測；碰撞氣為氮氣；氣簾氣（CUR）：20 psi；噴撞氣（CAD）：Medium；離子化電壓（IS）：5500 V；溫度（TEM）：500 ℃；噴霧氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣（GS2）：50 psi；接口加熱（ihe）：on；碰撞室入口電壓（EP）：10 V；碰撞室出口電壓（CXP）：6 V；保留時間：2.13 min；221.1/109.1的碰撞電壓為24 eV，221.1/127.1的碰撞電壓為21 eV，其中221.1/109.1為定量離子。

2 結果

2.1 色譜圖及質譜圖

空白血液及添加敵敵畏血液的液質聯用儀色譜圖及質譜圖，如圖1～2所示，結果顯示在選擇的實驗條件下，血液中的雜質不影響敵敵畏的測定。

圖1 空白血色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank blood

圖2 血中添加敵敵畏色譜圖及質譜圖Fig.2 Chromatogram and mass spectrum of DDVP-spiked blank blood

2.2 回收率及精密度實驗

精密吸取15份空白全血1 mL，分為3組，每組分別添加敵敵畏標準品，濃度為0.5、1、4 μg/mL，按1.2.2全血樣品處理項方法處理測定，見表2。

表2 敵敵畏回收率及精密度(n=5)Table 2 Recoveries (REC) and relative standard deviations(RODS) of DDVP (n=5)

2.3 工作曲線

取空白全血分別添加敵敵畏標準品濃度為0.02、0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 2.0、 4.0、 6.0 μg/mL，按 1.2.2全血樣品處理項方法處理測定，以峰面積（y）-敵敵畏濃度（x）為坐標做工作曲線，曲線方程為

y=7.63e5x+3.93e3，其r值為0.9991，線性范圍為0.02 ～ 6.0 μg/mL，最低檢出限為 0.002 μg/mL，S/N>3。

2.4 溫度對保存血液中敵敵畏含量變化的影響

5種濃度敵敵畏在不同溫度下血液中的含量變化見圖 3～7。

圖3 濃度為0.36 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.3 DDVP of 0.36μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

圖4 濃度為0.72 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.4 DDVP of 0.72μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

圖5 濃度為1.5 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.5 DDVP of 1.5μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

圖6 濃度為3.0 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.6 DDVP of 3.0μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

圖7 濃度為5.3 μg/mL的敵敵畏在不同溫度保存血中含量變化Fig.7 DDVP of 5.3μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

采用 WinNonlin 藥代動力學軟件處理保存血液的平均藥物濃度-時間數據，結果顯示，在 -20 ℃和4 ℃條件下分解均符合一級動力學過程一室開放模型，可以用Ct=Coe-αt(Ct 為時間 t 測得的含量；Co表示初始含量；t 表示時間，單位:d；α為分解速率常數)表示，在20 ℃保存環(huán)境下分解過快，不宜用動力學方程表示，分解動力學參數見表 4。

表4 敵敵畏分解動力學參數Table 4 DDVP decomposition kinetics parameters

同一保存環(huán)境不同濃度敵敵畏的分解速率常數α均相近，在-20 ℃保存環(huán)境下，分解速率常數α取平均0.023，分解動力學方程為Ct=Coe-0.023t，半衰期為30.13 d；在4℃保存環(huán)境下，分解速率常數α取平均0.35，分解動力學方程為Ct=Coe-0.35t，半衰期為1.98 d。濃度為3.0 μg/mL的敵敵畏在-20 ℃及4℃保存環(huán)境中濃度-時間曲線如下圖8～9。

圖8 濃度為3.0μg/mL的敵敵畏在-20℃保存環(huán)境中濃度-時間曲線Fig.8 The C-T (concentration-time) curve of DDVP at 3.0 μg/mL in blood stored under -20℃

圖9 濃度為3.0μg/mL的敵敵畏在4℃保存環(huán)境中濃度-時間曲線Fig.9 The C-T (concentration-time) curve of DDVP at 3.0μg /mL in blood kept under 4℃

3 討論

目前研究表明，保存檢材中毒物的分解動力學主要受保存條件的影響，包括溫度、時間、器皿類型、防腐劑、pH值及其它等[11]。其中，溫度是影響保存生物檢材中毒物分解主要因素之一，毒物在生物檢材中的分解速度與保存溫度相關。本實驗采用血液中不同濃度的敵敵畏在-20、4、20 ℃保存條件下含量的變化，系統的研究敵敵畏在人血檢材中的分解動力學規(guī)律。結果顯示，不同濃度敵敵畏含量在-20、4、20 ℃保存條件中均呈下降趨勢，隨著溫度的升高，敵敵畏降解速度加快。在-20 ℃條件下，保存120 d仍然可以檢測到的敵敵畏的存在；在 4 ℃條件下，敵敵畏在 12 d后未能檢出；在20 ℃條件下，4 d后即檢測不出敵敵畏。由此可以得出：隨著溫度的升高，各檢材中敵敵畏分解加快，穩(wěn)定性降低。在-20 ℃條件下，敵敵畏具有較好的穩(wěn)定性，在120 d仍可檢出。這也提示日常工作中，由于各種原因導致采取檢材后無法立即送檢、檢驗的，應當低溫保存。-20 ℃條件下，120 d檢材中敵敵畏含量約為初始含量的 10%，因此在低溫條件下保存的敵敵畏檢材也應盡快送檢、檢驗，以免長時間保存造成敵敵畏分解而無法檢測。實驗結果顯示，用所擬合的Ct=Coe-αt公式和參數計算的血中敵敵畏的理論值與實測值接近，說明應用血中毒物分解動力學數學模型和參數，可以模擬生物檢材中敵敵畏濃度的經時變化，估算檢材保存期間任一時間的毒物濃度；同時顯示在同一保存溫度下，不同濃度的敵敵畏在血液中的分解速率常數α及半衰期相近，判斷不同濃度的敵敵畏在同一保存條件下分解速率相近。在敵敵畏中毒（死）案件法醫(yī)學鑒定時，可采用此分解動力學方程和參數來推斷檢材采取當時或中毒死亡當時的毒物濃度，正確分析和使用毒物分析結果，為敵敵畏中毒（死）案件法醫(yī)學鑒定提供科學依據。

綜上所述，敵敵畏在保存血液中極不穩(wěn)定，分解很快，低溫保存可以減緩其分解，分解動力學過程可用一級動力學過程一室開放模型來描述。敵敵畏中毒（死）案件法醫(yī)學鑒定中，檢材應低溫冷凍保存，立即送檢并檢驗。如果檢材保存時間較長，可用其分解動力學方程和參數估算檢材采取或送檢當時的敵敵畏濃度。

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