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      接觸性檢材的DNA自動化提取

      2018-05-05 02:33:54王穎希張慶霞薛盧艷霍振義焦章平
      刑事技術(shù) 2018年2期
      關(guān)鍵詞:基因座檢材磁珠

      王穎希,張慶霞,薛盧艷,李 程,杜 娟,霍振義,焦章平

      (北京市公安司法鑒定中心,北京 100192)

      案件接觸性檢材主要指人體與物體接觸所遺留的表皮脫落細胞(下文簡稱脫落細胞),故嫌疑人使用的工具、戴過的手套、遺留的指紋等都可能含有不同數(shù)量的脫落細胞。接觸性檢材的DNA含量微,降解程度高,目前公安DNA實驗室主要以磁珠法提取,工作量大、耗時長。但接觸性檢材數(shù)量卻日益增多,而對檢驗時間的要求越來越迫切,故DNA檢驗工作的壓力越來越大[1-3]。DNA提取是檢驗的關(guān)鍵,獲得的DNA模板質(zhì)量直接影響著后續(xù)實驗。自動化工作站提取方式具有高通量批量處理功能,可有效提升檢材處理效率,降低勞動強度[4]。但以往的自動化提取方法對微量DNA的提取能力存在不足,能否適用于批量處理接觸性檢材還需進一步改進和驗證[5,8]。本文以KingFisher磁珠純化儀結(jié)合超微量磁珠法提取試劑盒,建立了自動、高通量提取接觸性檢材DNA的新方法。測試結(jié)果顯示該方法適用檢材范圍廣,樣品處理效率高,DNA有效檢出率達71.5%,效果令人滿意。

      1 材料與方法

      1.1 材料、儀器和試劑

      標(biāo)準(zhǔn)品 2800 M(濃度:10 ng/μ L,promega公司);自制指紋樣本,7人的食指、中指、無名指分別在載玻片上各按一枚指紋,力度適中,按壓時間5 s左右,共21枚指紋樣本。本實驗室日常案件送檢的接觸性檢材(均為棉簽擦拭脫落細胞或脫落細胞粘取器粘取的脫落細胞,如窗框拭子、作案工具拭子、嫌疑人遺留現(xiàn)場物品的粘取物等),共計870份,檢材未做區(qū)分。KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)(低通量版及高通量版)(博坤生物公司)、ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒(博坤生物公司)、ProFlex? PCR系統(tǒng)(Thermo公司)、3500xL基因分析儀(ABI公司)、ID Plus擴增試劑盒(ABI公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 提取

      不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA的回收實驗。取DNA標(biāo)準(zhǔn)品 2800M(10 ng/μ L)5μ L 加入到 495 μ L 高純水中,稀釋成0.1 ng/μ L的純DNA標(biāo)準(zhǔn)品;分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5 μ L稀釋后樣本,使用ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒對其消化,進行0.1、0.15、0.2、0.25 ng純DNA回收實驗,洗脫體積為30 μ L,每個濃度平行進行10次試驗。將預(yù)處理后的消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)(低通量版,24道)進行自動化DNA提取。

      單枚指紋DNA提取實驗。利用擦拭1號(博坤生物公司),按照干濕標(biāo)準(zhǔn)兩步法對載玻片上指紋樣本進行擦拭后放入1.5 mL離心管中。按試劑說明書使用ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒對其進行消化。將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)(低通量版)進行自動化DNA提取。

      案件接觸性檢材檢驗實驗。棉簽擦拭物檢材直接剪取棉頭表層并置于離心提籃內(nèi);脫落細胞粘取器粘取物直接取整個膜片放入1.5 mL離心管管底。除KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)選用高通量版外,其余同“單枚指紋DNA提取實驗”操作。

      1.2.2 擴增及電泳分析

      提取DNA的溶液采用ID Plus擴增試劑盒經(jīng)ProFlex? PCR系統(tǒng),以10 μ L體系(模板均為1μ L)擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)3500xL遺傳分析儀進行檢測,GeneMarker軟件進行STR分型(RFU>50)。未檢出或檢出10個基因座以下視為非有效檢出,檢出10個及以上基因座則作有效檢出。

      2 結(jié)果

      2.1 不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA回收實驗

      將各樣本STR分型圖譜與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA分型進行比對,結(jié)果顯示所有樣本均得到準(zhǔn)確分型(表1),但0.1 ng標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本有一個在D7S820基因座缺失一個位點,另一個其RFU峰值偏低,只有51。其他0.15、0.2、0.25 ng標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本均檢出完整STR分型。

      表1 不同起始量標(biāo)準(zhǔn)DNA回收樣本檢測結(jié)果Table 1 Standard DNA recoveries from different initial quantities of DNA

      2.2 單枚指紋樣本檢測結(jié)果

      將樣本檢出分型與被取樣者的分型比對(表2),其中11個樣本檢出10個以上基因座的單一分型,且與被取樣者分型一致;雖有1個混合分型,但以被取樣者的分型為主要峰型。非有效DNA檢出率為42.8%;有效DNA檢出率為57.2%。

      表 2 單枚指紋樣本檢測結(jié)果Table 2 Amount of exposed STR loci of the DNA extracted from single fingerprints

      2.3 實際案件檢材檢測結(jié)果

      870例實驗檢材檢驗結(jié)果見表3。

      表 3 870例案件送檢脫落細胞類檢材檢測結(jié)果Table 3 Statistics of detected STR loci of exfoliated cells from 870 contact samples collected in daily forensic casework

      其中206個樣本檢出單一16基因座分型,22個樣本檢出單一13~15基因座分型,51個樣本檢出單一10~13基因座分型,343個樣本檢出混合16基因座分型;70個樣本檢出10基因座以下分型,178個樣本未檢出分型。未檢出或10基因座以下分型視為非有效DNA提取,占比為28.5%;故有效DNA檢出率為71.5%。

      3 討論

      據(jù)文獻報道,接觸性檢材DNA含量普遍在0.1~1.5 ng之間[9]。對這類微量疑難檢材DNA的提取,需對從提取試劑到所用儀器的各個環(huán)節(jié)進行優(yōu)化[10]。本研究選用KingFisher磁珠提取純化系統(tǒng)結(jié)合博坤超微量磁珠法DNA提取試劑盒進行試驗,得到了較高的檢出率,原因可能如下:該試劑盒磁珠顆粒小,使其吸附DNA的面積更大,故可在磁珠表面富集更多的DNA,而其磁珠的超順磁性又保證了更好的懸浮性和分散性;加之所選用自動化工作站采用磁棒插入磁套浸進液體進行吸附,磁套離開磁棒后置于溶液進行釋放,相比通過磁力架反應(yīng)的傳統(tǒng)磁珠法可以提高檢出率。另外,該系列儀器可根據(jù)檢材條件而改變洗脫體積,故更有利于從微量脫落細胞樣本中獲得更高濃度的模板DNA。

      本研究首先對選用的自動化提取系統(tǒng)進行提取靈敏度的測試。選擇濃度可準(zhǔn)確量化的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本,結(jié)果顯示該自動化系統(tǒng)可對含量低至0.1 ng的標(biāo)準(zhǔn)DNA成功回收,獲得的STR分型也相對完整,表明該自動化系統(tǒng)具有較高的提取靈敏度。

      指紋是案件現(xiàn)場典型的接觸性檢材,而其中脫落細胞含量卻普遍較少,故屬疑難類接觸性檢材。利用本文所建方法對實驗室制備的單指紋樣本進行提取,STR分析顯示有效DNA檢出率可達到57.2%,為目前指紋DNA檢驗的較好結(jié)果。而且,由于整個提取過程全部自動化處理,方法的重復(fù)性高,能為穩(wěn)定可靠的大批量處理接觸性檢材DNA提供保障。在實際樣本的驗證實驗中,所選取的均為實際案件現(xiàn)場經(jīng)采樣工具二次轉(zhuǎn)移的接觸性檢材。經(jīng)STR檢驗分析,有效DNA檢出率達到71.5%,其中單一16基因座分型檢出率為23.7%。這一結(jié)果即便與手工精細操作相比也令人滿意,表明自動化系統(tǒng)應(yīng)用于接觸性檢材批量提取純化是切實可行的。

      KingFisher磁珠純化儀可應(yīng)用于日常案件檢驗,其中高通量版可以同時處理96個樣本。磁珠顆粒小,富集效率高,洗脫體積靈活,均有利于從微量接觸檢材中獲得高濃度的模板DNA;又因其適用檢材類型廣,能有效提高各類檢材DNA的檢出率,因而可降低檢驗成本。磁珠法整合自動化工作站能有效控制人為因素對實驗的影響,減少DNA損失,同時還可避免樣本間的交叉污染,結(jié)果的準(zhǔn)確性更有保障,實驗時間更短,提取96個樣本僅需1 h 3 min。

      [1] 王琴,章申峰,李佑英,等.微量脫落細胞DNA檢驗方法的比較分析[J].刑事技術(shù),2014(4):54-55.

      [2] 駱繼懷,陳曉軍,孫紅兵,等.接觸性生物檢材提取方法的比較[J].蘭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2015, 41(1): 18-22.

      [3] 廖長青,成靜,劉維. Chelex-100法和QIAcube純化法在接觸性檢材檢驗中的比較[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2015, 31(2):148-149.

      [4] 嚴(yán)江偉,王順霞,任賀,等. 應(yīng)用自動化工作站提取常見生物樣本DNA [J]. 中國法醫(yī)學(xué)雜志,2007,22 (2):73-75.

      [5] 郝宏蕾,吳微微,蘇艷佳,等.批量陳舊血樣DNA的自動化檢驗[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2011,26(2):122-123.

      [6] 姜先華,侯光偉,李軍,等. 應(yīng)用DNA工作站進行批量血斑STR分型的研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2007,22(1):1-4.

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      [9] RAYMOND J J, OORSCHOT R A H V, GUNN P R, et al. Trace DNA success rates relating to volume crime offences[J]. Forensic Science International Genetics Supplement, 2009, 2(1):136-137.

      [10] 匡金枝,聶同鋼,楊智,等.法醫(yī)物證DNA自動化檢驗技術(shù)體系的研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2009, 24(3): 164-167.

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