丁 佳， 呂莎平， 劉躍進(jìn)， 吳志民， 李勇飛， 潘浪勝

(湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南湘潭 411105)

芹菜素作為一種天然黃酮類化合物，因其獨(dú)特的藥理功能和生物活性被廣泛地應(yīng)用于藥物研究中，研究表明芹菜素具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]和抑制癌細(xì)胞的生長[4]等作用。另外，芹菜素還與能Bcl-2在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中發(fā)揮重要作用[5]。因此，研究芹菜素的提取分離與應(yīng)用具有十分重要的意義。

分子印跡技術(shù)是一種基于分子印跡聚合物(MIPs)對特定目標(biāo)化合物的選擇吸附作用[6 - 7]的技術(shù)。多壁碳納米管(MWCNTs)作為一種新型的高強(qiáng)度碳纖維材料，具有機(jī)械性能好、電學(xué)性能強(qiáng)和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[8]。研究表明在碳納米管表面接枝MIPs是可行的[9 - 10]，這種新型的材料MWCNTs-MIPs，既有碳納米管超強(qiáng)的力學(xué)性能和電學(xué)性能，又有MIPs專一選擇識別性能，使得分子印跡點(diǎn)位完全暴露在基質(zhì)表面，克服了空間位阻的影響，提高分子印跡材料的選擇吸附效率。同時(shí)，以碳納米管為微固相萃取材料的固相萃取技術(shù)的專一性較強(qiáng)[11 - 13]。

本文以羧基化多壁碳納米管為基材，結(jié)合分子印跡技術(shù)，以芹菜素作為模板分子，成功制備了一種基于碳納米管的新型印跡復(fù)合材料(MWCNTs-MIPs)，并通過掃描電鏡(SEM)，傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜和比表面積分析(BET)對該材料進(jìn)行表征。另外，對聚合物的靜態(tài)吸附性能與選擇性進(jìn)行研究，同時(shí)還對固相萃取方法進(jìn)行了重現(xiàn)性研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

PerkinElmer Series200高效液相色譜儀(PerkinElmer)；DF-10型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KQ220E型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；DZ-CII真空干燥箱(上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

芹菜素(陜西慧科植物開發(fā)有限責(zé)任公司)；羧基化碳納米管(內(nèi)徑：20～30 nm；長度：10～30 μm，北京德科島金科技有限公司)；偶氮二異丁腈(AIBN，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，阿拉丁試劑有限公司)；氯化亞砜、丙烯酰胺(AM)(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；二甲基甲酰胺(DMF，廣東汕頭市西隴化工廠)。試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 碳納米管印跡材料的制備

1.2.1MWCNTs-CH=CH2的制備參照文獻(xiàn)方法[14]，稱取0.45 g MWCNTs-COOH溶解于50 mL氯化亞砜中，超聲15 min后加熱回流攪拌24 h。待反應(yīng)結(jié)束后，采用減壓蒸餾法回收二氯亞砜，得到目標(biāo)產(chǎn)物MWCNTs-COCl。再將產(chǎn)物MWCNT-COCl和1.2 g AM溶于100 mL DMF中，超聲15 min后，于25 ℃ 下回流攪拌24 h。待反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，真空抽濾，得到粗產(chǎn)物。然后分別用0.12 mol/L HCl和蒸餾水洗滌至中性，70 ℃真空干燥過夜，得MWCNTs-CH=CH2。

1.2.2納米管芹菜素分子印跡聚合物的制備稱取0.1081 g芹菜素和0.1139 g AM，溶解于80 mL丙酮中，超聲30 min，然后加入0.2 g的 MWCNT-CH=CH2，繼續(xù)超聲20 min并靜置1 h，使模板分子與功能單體充分反應(yīng)。然后依次加入1.58 g交聯(lián)劑EGDMA和20 mg AIBN。通氮?dú)?0 min后，于60 ℃恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h。待反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，真空抽濾后，收集濾液采用減壓蒸餾法回收丙酮。濾餅用乙醇反復(fù)洗滌，以除去未參與反應(yīng)的模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等雜質(zhì)。

初洗后的濾餅裝于索氏提取器中，以甲醇-乙酸混合液(9∶1，V/V)作洗脫劑，回流提取24 h后，洗去模板分子，然后用蒸餾水洗滌至中性。將得到的產(chǎn)物于80 ℃下真空干燥24 h。非印跡材料(MWCNT-NIPs)的制備除不加模板分子外，其它步驟均與上述相同。

1.3 聚合物的靜態(tài)吸附性能實(shí)驗(yàn)

為了研究多壁碳納米管芹菜素分子印跡聚合物的吸附性能，考察了振蕩時(shí)間對吸附容量的影響。具體步驟如下：分別稱取8等份20 mg的MWNT-MIPs和MWCNTs-NIPs，加入到10 mL 0.2 mmol/L的芹菜素乙醇溶液中，然后放入恒溫箱中分別振蕩10、30、60、90、200、300、400和500 min，取上層清液，微孔濾膜過濾后用高效液相色譜法(HPLC)測定芹菜素的濃度，平行測定三次，取平均值。計(jì)算其對芹菜素的吸附容量Q；Q=(c0-c) ×V/m,式中Q表示聚合物的吸附容量(mmol/g)；c和c0分別表示芹菜素的初始濃度和吸附后上清液中芹菜素的濃度(mmol/L)；V表示溶液的體積(mL)；m表示質(zhì)量(g)。繪制吸附動力學(xué)曲線。

1.4 選擇性吸附實(shí)驗(yàn)

1.5 印跡聚合物固相萃取

稱取50 g MWCNTs-MIPs，采用干法裝入帶有篩板的固相萃取柱中，上端用玻璃棉封堵。首先，選用1 mL芹菜素?zé)o水乙醇溶液上樣，對不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液的淋洗液進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出最佳體積分?jǐn)?shù)的淋洗液；然后取溶于乙醇的芹菜提取物溶液上樣，先用最佳體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液淋洗，再用無水乙醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫，用HPLC法進(jìn)行分析。

1.6 HPLC檢測條件

色譜條件：Diamonsil C18柱(250×4.6 mm，5 μm；迪馬科技有限公司)；流動相：甲醇-0.5%的磷酸溶液(70∶30，V/V)；流速：1 mL/min；檢測波長：348 nm；柱溫：室溫。

精密稱取5.4、16.2、27.0、37.8、54.0 mg芹菜素，以無水乙醇為溶劑，配制體積為200 mL，濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)溶液。HPLC法檢測進(jìn)樣量均為6 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電鏡(SEM)表征

采用SEM分別對MWCNTs-COOH、MWCNT-CH=CH2、MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs進(jìn)行形貌表征。從圖1可以看出，MWCNTs-COOH呈單一的納米管狀或小的束狀，管徑大約為20 nm。同樣在放大20倍下，MWCNTs-CH=CH2均勻變大，這表明雙鍵已經(jīng)均勻接枝在碳納米管上。從MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的SEM圖中可看出，經(jīng)過接枝修飾的MIPs和NIPs管徑都均勻增大，但兩者相差不大，約為30～40 nm。與圖1(B)比較可知，MWCNTs-MIPs的管徑大于MWCNT-CH=CH2的管徑，這說明聚合物已經(jīng)均勻的接枝在碳納米管表面，印跡層厚度為10～20 nm。

圖1 MWCNTs-COOH(A)、MWCNTs-CH=CH2(B)、MWCNTs-MIPs(C)和MWCNTs-NIPs(D)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of MWCNTs-COOH(A)，MWCNTs-CH=CH2(B)，MWCNTs-MIPs(C)and MWCNTs-NIPs(D)

2.2 紅外光譜分析

圖2 MWCNTs-COOH、MWCNTs-CH=CH2和MWCNTs-MIPs的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of MWCNTs-COOH,MWCNTs-CH=CH2 and MWCNTs-MIPs

圖2為MWCNTs-COOH、MWCNTs-CH=CH2和MWCNTs-MIPs的紅外光譜圖。從圖2中可以看出，MWCNTs-COOH的紅外光譜圖的吸收峰最少，這是因?yàn)樗休^簡單的有機(jī)結(jié)構(gòu)。在MWCNTs-COOH、MWCNTs-CH=CH2和MWCNTs-MIPs的紅外圖譜中，3 050～3 600 cm-1處有較寬的彌散吸收峰，這是-OH和C-H吸收峰疊加所致。在MWCNTs-CH=CH2的紅外譜圖中，1 628 cm-1處出現(xiàn)一個雙鍵的特征吸收峰；而MWCNTs-MIPs的紅外譜圖中，1 455～1 600 cm-1附近出現(xiàn)苯環(huán)骨架振動吸收峰，800～1 000 cm-1間是-(CH2)n-的搖擺振動峰，2 800～3 000 cm-1處是 -CH3的特征峰，1 270～1 050 cm-1處是-C-O-C-的振動吸收峰；此外，1 730 cm-1處的是酯羰基吸收峰，強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，這是由于MWCNTs-MIPs高分子層是EGDMA和AM共聚而來。以上結(jié)果說明MIPs被成功接枝到MWCNTs上，形成對芹菜素具有獨(dú)特識別功能的MWCNTs-MIPs。

2.3 比表面積分析

采用比表面分析(BET)測定了MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的比表面積、孔徑和總孔容。由表1可知，MWCNTs-MIPs的比表面積、總孔容都大于MWCNTs-NIPs，由于提供了較大的空間，因此更有利于模板分子的吸附，并且吸附容量要大于傳統(tǒng)方法合成的印跡聚合物。

表1 MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的BET表征結(jié)果

圖3 MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的吸附動力學(xué)曲線Fig.3 Adsorption kinetics of MWCNTs-MIPs and MWCNTs-NIPs

2.4 模板分子對印跡聚合物吸附性能的影響

圖3是MWCNTs-MIPs及MWCNTs-NIPs的吸附動力學(xué)曲線。從圖中可以看出，MWCNTs-MIPs在前20 min內(nèi)吸附容量迅速增加，在200 min時(shí)已基本達(dá)到平衡。而MWCNTs-NIPs的吸附容量100 min達(dá)到最大。這是由于MWCNTs-MIPs 的孔穴由芹菜素分子所印跡，生成較大的孔穴有利于模板分子的傳質(zhì)，因此在吸附實(shí)驗(yàn)開始時(shí)呈現(xiàn)出較快的吸附速率。但隨著時(shí)間的增加，當(dāng)MWCNTs-MIPs表面的識別位點(diǎn)被結(jié)合以后，由于其向MWCNTs-MIPs孔穴的傳質(zhì)有一定的空間位阻使吸附速度逐漸下降。而MWCNTs-NIPs中由于不存在與模板分子結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的有序排列的立體孔穴，因此它主要是通過非模板聚合物表面的非特異性吸附作用來吸附芹菜素，所以很快就能達(dá)到吸附平衡。

2.5 印跡聚合物的選擇性能

由表2可知，MIPs對芹菜素產(chǎn)生了較為明顯的印跡效果，而對其結(jié)構(gòu)類似物木犀草素的吸附性相對較差。這是由于在聚合過程中，以芹菜素為模板分子，使得MIPs中存在與芹菜素結(jié)合的功能基團(tuán)，同時(shí)也留下了與芹菜素的立體結(jié)構(gòu)能互補(bǔ)的特殊空穴，這些均使得MIPs對芹菜素有著特殊的識別性能。由此可見，MWCNTs-MIPs對模板分子芹菜素有著較好的選擇性吸附性能。

表2 MWCNTs-MIPs和MWCNTs-NIPs的選擇性系數(shù)

2.6 淋洗液的優(yōu)化

在淋洗的步驟中，考慮到乙醇極性較大、溶解性能好，能夠溶解較多的非特異吸附的雜質(zhì)，因此我們采用了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(50%、25%和10%)進(jìn)行淋洗液的篩選。結(jié)果表明，當(dāng)采用10%的乙醇溶液作為淋洗液時(shí)，淋洗效果最好，它能有效地除去雜質(zhì)而保留芹菜素。

2.7 芹菜提取物中芹菜素的固相萃取

圖4 芹菜提取液的色譜圖Fig.4 Chromatograms of celery extracts1-apigenin；(a)extracts of celery；(b)leachate；(c)eluent.

取1 mL芹菜提取液的無水乙醇溶液上樣后，先用10%乙醇溶液淋洗，再用無水乙醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每1 mL收集一次洗脫液，然后進(jìn)行HPLC法分析，芹菜提取物的色譜圖如圖4所示。結(jié)果表明，經(jīng)10%乙醇溶液淋洗和經(jīng)無水乙醇洗脫的固相萃取操作后，洗脫液中芹菜素的含量有所提高，芹菜素得到有效純化和富集。

2.8 印跡聚合物固相萃取方法的重現(xiàn)性

為了研究碳納米管分子印跡聚合物固相萃取方法的重現(xiàn)性，碳納米管分子印跡聚合物固相萃取1次后，按照上述操作條件重復(fù)操作5次，其樣品純度和回收率見表3。由表3可知，碳納米管分子印跡聚合物重復(fù)操作5次，分離效果基本不變，能使芹菜素的純度由0.53%提高至90.93%，回收率可達(dá)到95.84%，對芹菜素有較好的分離富集效果，富集因子高達(dá)171.6。

表3 固相萃取方法重現(xiàn)性(n=5)

3 結(jié)論

本文成功制備了一種基于碳納米管的新分子型印跡復(fù)合材料(MWCNTs-MIPs)，并通過SEM、FT-IR和BET對聚合物進(jìn)行表征。MWCNTs-MIPs對芹菜素呈現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力和選擇識別能力，其吸附容量遠(yuǎn)大于MWCNTs-NIPs。對芹菜提取物進(jìn)行了固相萃取研究，結(jié)果表明該技術(shù)具有良好的重現(xiàn)性，對芹菜素富集因子高達(dá)171.6，為芹菜素的分離富集提供了一條新的途徑。

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