劉 歡，白 拖，曹婉婷，徐夢妮，黃 婷*

（1.西安石油大學 化學化工學院，陜西 西安 710065；2.安康學院 化學化工學院，陜西 安康 725000）

鉛難以被微生物自然降解，微量的鉛會隨著食物鏈慢慢在人體及動物體內(nèi)累積，當鉛累積至一定量時，便會對人體的九大系統(tǒng)造成一定程度的損害。當前，鉛污染已對人類生存環(huán)境造成了嚴重的威脅，所以，控制鉛污染是十分必要的。目前，檢測鉛含量的方法如光譜、質(zhì)譜、色譜和電化學分析法已經(jīng)開發(fā)出來[1-4]，這些方法雖然檢測靈敏度高、選擇性強、準確度高，但大多依賴大型儀器設備、耗時、費用高、不便攜帶，并需要訓練有素的專業(yè)技術人員對復雜樣品進行預處理，不利于現(xiàn)場監(jiān)測鉛含量。因此，人們對研究一個具有高靈敏度、高選擇性、低費用、能實時分析，以及需要少量的樣品預處理就可以檢測鉛的方法充滿興趣。

研究表明，脫氧核酶DNA分子對許多特定的化學反應具有高催化活性。1994年首次報道“8-17”脫氧核酶對鉛具有高特異性[5]，反應機理主要是當出現(xiàn)Pb2+時，酶鏈將底物鏈剪切成兩段[6-8]。同時，基于“8-17”脫氧核酶檢測Pb2+的各種生物傳感器已經(jīng)被設計出來，其檢出限范圍是皮摩爾水平到微摩爾的水平[9-10]。然而，大多數(shù)生物傳感器因其操作的復雜性不適合現(xiàn)場測試，陸和[11]研究出一個方便又實用的涂有“8-17”脫氧核酶和納米金的試紙來檢測Pb2+，檢出限為0.5μmol/L，但是，它在一些特定條件下不夠敏感，不能滿足檢測需求。因此，仍然需要進一步優(yōu)化和改進以獲得較低的檢出限。

Mirkin等人首次提出生物條形碼檢測技術[10]，主要基于功能化納米金與特定的探針，可以識別具體目標分析物和大量的寡核苷酸鏈。這些作為代理靶標具有相同序列的寡核苷酸鏈被稱為條形碼，它們很容易被其相應識別代理捕獲，從而有效地增強檢測靈敏度[12-13]。同時，大量條形碼的存在可以大大降低了特定探針的使用。通過使用生物條形碼檢測技術檢測DNA，使其檢測靈敏度達到納摩爾級，并具有選擇性高、準確性強、簡單和成本低的優(yōu)點，可以對Pb2+現(xiàn)場檢測[14]。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

鏈酶親和素（SA），上海生物源葉有限公司；塑料粘合底板、NC（硝酸纖維）膜、結合墊、吸水墊、樣品墊，上海杰一生物有限公司；鉛（Pb(NO3)2），天津化學試劑廠；17E酶鏈、17DS地物分解鏈、條形碼DNA、捕獲DNA，生工生物工程（上海）有限公司；牛血清蛋白（BSA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、磷酸鹽緩沖液 （PBS）、鹽酸胍 （Gu-HCl）、琥珀4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸（SMCC），Sigma-Aldrich公司；納米金 （AuNPs），南京吉倉納米材料有限公司。

鉛標準儲備液的配制（100 nmol/L）：準確稱取0.0033g硝酸鉛（分析純），加入少量水溶解，定容于100 mL容量瓶中，得到濃度為100nmol/L的鉛標準溶液，再分別配置濃度為50 nmol/L、20 nmol/L、10 nmol/L、5 nmol/L、0 nmol/L的鉛標準溶液。

將1mg鏈霉親和素溶解于1mL水中，得到濃度為1mg/mL的鏈霉親和素溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 試紙條組成材料的選擇

1.2.1.1 樣品墊的選擇。樣品墊的作用：（1）吸收樣品，可使樣品均勻混合并遷移到結合墊和NC膜；（2）以防檢測時測試樣品浸漬超重；（3）過濾樣品中的顆粒物、懸浮物、有色雜質(zhì)等；（4）可被化學物質(zhì)浸潤，以實現(xiàn)對樣品的功能化改性。選擇樣品墊時，應注意樣品墊不能與所測試的材料發(fā)生任何反應，所以樣品墊通常由對水有大的親和能力的惰性材料制成。本實驗選用GL-b01樣品墊。

1.2.1.2 結合墊的選擇。結合墊材料需滿足以下條件：（1）對水有大的親和能力，可以吸收納米金探針，在其有效的質(zhì)量保證期內(nèi)，當樣品通過結合墊時，使納米金探針獲得有效釋放。結合墊應該完全可逆吸附或者釋放納米金探針；（2）流動性好，確保樣本可以均勻地遷移到NC膜；（3）不允許與樣品反應，也不能與任何測試對象發(fā)生反應。本實驗選用Ahlatrom 9864金墊。

1.2.1.3 反應膜的選擇。反應膜須具以下特性：（1）高蛋白吸附功能使得測試線順利形成；（2）非特異性結合盡量達到最小，以便讀取測試結果。本實驗選用NC膜作為反應膜材料。

1.2.1.4 吸收墊的選擇。測試條的尾端就是吸收墊，它的作用是吸收反應膜上過剩的樣品。添加吸收墊后，樣品可流動到反應膜末端，從而對其進行分析。選用合適的材料充當吸收墊至關重要，應選擇吸水性好且吸水容量大的親水性材料充當吸收墊。本實驗選用H-5072吸收墊。

1.2.2 測試條的制備

將25mm長的硝酸纖維（NC）膜貼在塑料粘合底板上，再將15mm長的吸收墊放在一邊，長約15mm的結合墊放在另一邊，最后，將長約15mm的樣品墊粘貼在結合墊上面。所有的搭接接口有2mm的重疊，測試條的寬度為4mm。將濃度為1mg/mL的鏈霉親和素和濃度為100μ mol/L的捕獲DNA-BSA軛合物分別涂在控制區(qū)域（線C）和測試區(qū)域（檢測線T），將納米金結合物涂在結合墊上。然后在37℃的溫度下，干燥測試條4小時，再將其保存在干燥器中。

圖1 測試條結構圖

1.2.3 測試條的檢測原理

在纖維膜上將涂入的已知抗體或者抗原包裹，待測試樣品加入后，樣品中的抗原或者抗體在纖維膜的毛細作用下遷移，與纖維膜上的抗體或者抗原發(fā)生反應，進而與納米金標記物發(fā)生反應，形成檢測紅線，達到了檢測目的。

1.2.4 鉛的測定方法

將測試條的樣品墊浸入樣品溶液中約2 min，直到液體已經(jīng)遷移到硝酸纖維（NC）膜并且完全水化結合墊，然后將測試條立即水平放置讓其繼續(xù)流動。約6 min后，可以直觀地看到測試結果。即不含鉛Pb2+的樣品中，只在控制區(qū)觀測到紅色線；含Pb2+的樣品中，控制區(qū)和測試區(qū)均出現(xiàn)紅色線。

1.2.5 樣品處理

取樣檢測漢江水，用孔徑為0.45μm的纖維素膜過濾，將某濃度的鉛標準液添加到水試樣里，調(diào)節(jié)pH值=7，備用。

2 結果與討論

2.1 檢測結果和機理

圖2為鉛離子測試條的結構及測量原理示意圖。如圖2 A所示，在結合墊上發(fā)現(xiàn)金納米共軛物?！?7DS-17E”雙鏈，就是“8-17”脫氧核酶，它包含一條酶鏈17E和一條分裂底物鏈17DS，對Pb2+有特異性?！?7DS-17E”的雙鏈都是DNA，腺嘌呤核糖核苷作為底物鏈17DS的一個分裂點。當Pb2+存在時，酶鏈17E在底物鏈17DS腺嘌呤核糖核苷處催化水解17DS，使17DS分裂為兩個片段。

在不考慮信息素的跡濃度揮發(fā)的理想狀態(tài)下，信息素的跡濃度增加和有效信息增加計算方式見表1，其中I表示螞蟻發(fā)現(xiàn)一處食物源并有效反饋的信息數(shù)值．

測試結果表明，當Pb2+不存在時，金納米結合物不分裂，并且遷移至硝酸纖維膜，直至控制區(qū)。在控制區(qū)，經(jīng)過特定的鏈霉親和素與生物素相互作用產(chǎn)生的鏈霉親和素可以捕獲生物素化的軛合物，從而產(chǎn)生一個控制線（如圖2 B）。當Pb2+存在時，17E酶鏈催化底物鏈17DS使其在腺嘌呤核糖核苷處裂開。因此，金納米結合物被分裂成三個部分：含生物素的DNA片段、17E酶鏈、含有條形碼DNA和殘留17DS的納米金結合物。被分裂的納米金結合物將遷移越過控制區(qū)直到測試區(qū)，條形碼DNA和互補的捕獲DNA雜化，從而在測試區(qū)形成紅色線。當然，未分裂的納米金結合物將被鏈霉親和素在控制區(qū)域捕獲。因此，控制區(qū)紅色線仍可觀測到。也就是說，兩個區(qū)域的觀測線均變紅，（如圖2 C），則表示Pb2+存在。

圖2 測試條的結構及測量原理示意圖

2.2 靈敏度

本實驗分別用0、5、10、20、50、100 nmol/L一系列標準濃度的Pb2+溶液，檢測測試條的敏感性，測試結果如圖3所示。當顯色只出現(xiàn)在硝酸纖維膜的控制區(qū)時，Pb2+溶液濃度低于10 nmol/L；顯色同時出現(xiàn)在硝酸纖維膜的控制區(qū)和測試區(qū)時，表明Pb2+濃度高于檢測極限，測試結果視為正常。因此10 nmol/L被認為是探測極限。

圖3 試紙的靈敏度分析

2.3 選擇性

為研究測試條的選擇性，對濃度均為0.1 mmol/L的其他二價金屬離 子 Hg2+、Cu2+、Ni2+、Mn2+、Cd2+、Fe2+溶液，以及濃度為10 mmol/L的Mg2+、Ca2+溶液，用測試條逐個分析。結果如圖4所示，硝酸纖維膜上只出現(xiàn)一個紅色的控制線，說明這些離子對試紙條的檢測不會造成干擾。

圖4 干擾金屬的測定

2.4 穩(wěn)定性

將測試條長期儲存在密封鋁袋中。在儲存期間，每月用10組測試條對Pb2+溶液和無Pb2+溶液進行測試，并統(tǒng)計分析這些測試條。結果顯示，測試條在三個月內(nèi)均沒有失去活性和顏色強度，表明測試條足夠穩(wěn)定。

2.5 樣品分析

為了驗證測試條的有效性，采用加標法，配制不同濃度梯度的Pb2+加標漢江水溶液作為樣品，濃度分別為0、5、10、20、50、100 nmol/L，用測試條檢測。實驗結果如下頁表1所示，Pb2+溶液濃度為0、5 nmol/L時，僅控制區(qū)出線紅色線，檢測線未有色；而當Pb2+溶液濃度為10、20、50、100 nmol/L時，檢測線和控制線均出現(xiàn)紅色線。實驗所測結果與對比結果一致，因而此測試條對Pb2+的檢測結果準確可信。

表1 試紙條檢測加標實際水樣結果（n=5）

3 結論

通過實驗測試研究，成功開發(fā)出基于脫氧核酶和條形碼DNA的功能化納米金目視檢測Pb2+的測試條。此方法檢測Pb2+靈敏度高，由于DNA條形碼的檢出限可達10 nmol/L，以及“8-17”脫氧核酶對Pb2+的特異性，使其對Pb2+具有高選擇性；測試條還具有足夠穩(wěn)定性，能長期使用，檢測過程不需任何儀器。因此，該測試條可作為一種簡單、快速、靈敏、選擇性高和低成本的工具用于現(xiàn)場檢測Pb2+含量。

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