山葵組培中抗褐化劑的篩選及其對增殖和生長的影響

劉香江， 楊 麗， 吳紅芝

(云南農(nóng)業(yè)大學，云南昆明 650201)

山葵[Wasabijaponica(Miquel)Matsum]別稱山崳菜，為十字花科山崳菜屬多年生草本半陰生植物，原產(chǎn)于中國和日本，是一種名貴珍稀的香辛蔬菜，其濃辛辣味郁，具有利尿、清熱、發(fā)汗、解毒、殺菌、增進食欲、預防血栓、抑制癌細胞生長等功效，被譽為“綠色黃金”，在日本、東南亞國家及港澳臺地區(qū)深受歡迎，是一種重要的出口創(chuàng)匯蔬菜[1-2]。目前，山葵主要采用種子和分株繁殖，但繁殖速度慢、品性易退化，而山葵組織培養(yǎng)技術可為山葵快速繁殖、復壯提供技術支持[3]。

褐化是由于植物材料在組織培養(yǎng)過程中受到傷害，體內(nèi)分泌的酚類物質(zhì)在酚氧化酶作用下被氧化成褐色的醌類物質(zhì)[4]，而醌類物質(zhì)對植物材料產(chǎn)生毒害作用，影響其生長和分化，嚴重時導致組織死亡。在山葵組培快繁試驗中發(fā)現(xiàn)，山葵是一種對外界環(huán)境刺激特別敏感的植物，不適合的光照、溫度、濕度、激素等外界因子都會對山葵生長造成影響，使其褐化，尤其在夏季最為嚴重。因此，解決山葵組培中的褐化問題是山葵組織培養(yǎng)的關鍵技術之一。目前，有關山葵組織培養(yǎng)的研究多集中在愈傷組織的誘導、苗的增殖、生根、復壯等，除劉琴研究認為山葵的褐化現(xiàn)象會嚴重影響愈傷組織誘導的成功率[5]外，有關其褐化的控制鮮見報道。本試驗以繼代培養(yǎng)的山葵無菌苗為材料，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的8種抗褐化劑，觀察統(tǒng)計山葵無菌苗褐化指數(shù)、增殖系數(shù)、生長情況等，篩選出既能較好地控制組培苗褐化，又不影響其生長的抗褐化劑類型及其適宜濃度，以期能較好地解決山葵組織培養(yǎng)過程中的褐化問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2016年在云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院組培室進行，供試山葵品種為島根3號，以山葵繼代培養(yǎng)獲得的叢生芽為試驗材料。

1.2 試驗方法

選取生長良好，且長勢一致的叢生芽接種到繼代培養(yǎng)基MS+0.25 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+蔗糖30 g/L+瓊脂6.25 g/L(pH值為6.0)上，培養(yǎng)基中分別添加活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、L-半胱氨酸、檸檬酸、抗壞血酸(維生素C)、二硫蘇糖醇(DTT)、硝酸銀(AgNO3)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)8種抗褐化劑，編號及使用濃度見表1，以不添加任何抗褐化劑的處理為對照。每處理接種10瓶，每瓶接種4株苗，每株苗3個芽，重復3次。每隔30 d統(tǒng)計1次褐化指數(shù)[6]、增殖系數(shù)和組培苗生長情況，共觀察記錄90 d。培養(yǎng)條件為溫度(16±1)℃，光照時間12 h/d、光照度7 200 lx。根據(jù)山葵組培苗褐化顏色，將山葵褐化程度分為無、淺、中、較深、深、最深共6級，分別用0、1、2、3、4、5表示，則褐化指數(shù)計算公式為：褐化指數(shù)=∑(褐化級別×相應褐化級別的株樹)/(調(diào)查總株樹×5)×100%。增殖系數(shù)計算公式為：增殖系數(shù)=(調(diào)查當日總芽數(shù)-接種芽數(shù))/接種芽數(shù)。組培苗生長情況根據(jù)肉眼觀察，調(diào)查葉的大小、葉色、莖粗細、是否有黃葉這4個指標。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010、SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同抗褐化劑對山葵組培苗褐化的控制效果

由表1可見，繼代培養(yǎng)第1個月時，山葵組培苗褐化程度相對較輕且緩慢，除DTT 0.035 g/L處理顯著高于對照(P<0.05)外，其他處理間差異不顯著；繼代培養(yǎng)第2個月時，不同抗褐劑對山葵組培苗的抗褐化效果表現(xiàn)出一定差異，除活性炭處理和AgNO32個低濃度處理沒有出現(xiàn)褐化外，其他處理均出現(xiàn)不同程度的褐化，其中，僅Na2S2O32.000 g/L處理的組培苗褐化指數(shù)顯著高于對照(P<0.05)；繼代培養(yǎng)第3個月時，不同抗褐化劑的整體抗褐化效果依次為AgNO3>活性炭>維生素C>DTT>檸檬酸>PVP>L-半胱氨酸>清水>Na2S2O3，其中，AgNO33個濃度處理的組培苗褐化指數(shù)為0，抗褐化效果顯著優(yōu)于對照(P<0.05)，抗褐化效果相對最好，活性炭抗褐化效果次之，3個濃度處理中，0.200、0.800 g/L處理的組培苗褐化指數(shù)為0，低濃度的PVP、L-半胱氨酸、維生素C、DTT及高濃度的檸檬酸也表現(xiàn)出較好的抗褐化效果，但均沒能完全消除褐化；繼代培養(yǎng)第3個月時，L-半胱氨酸0.200 g/L、維生素C0.025 g/L、Na2S2O32.000 g/L處理抗褐化效果相對較差，與對照相比，甚至加劇了山葵組培苗的褐化，而高濃度的Na2S2O3處理雖然褐化指數(shù)相對較低，但出現(xiàn)大部分植株死亡的現(xiàn)象。此外，本試驗中發(fā)現(xiàn)，AgNO30.025 g/L 處理在山葵組培苗繼代培養(yǎng)第2個月時出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，而在第3個月時褐化現(xiàn)象消失，這可能是由于山葵在密閉容器中或受傷后產(chǎn)生乙烯[7]，乙烯的大量積累會使山葵組培苗發(fā)生褐化，而AgNO3作為一種褐化抑制劑，其主要作用是抑制乙烯的產(chǎn)生[8]，銀離子通過競爭性結合位于細胞膜上的乙烯受體蛋白，以阻止或降低乙烯的作用[9]，從而防止褐化，而山葵繼代培養(yǎng)第2個月時，產(chǎn)生的乙烯量相對較大，AgNO3抑制乙烯的速度比不上產(chǎn)生褐化的速度。

表1不同抗褐化劑處理對山葵組培苗褐化的控制效果

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同抗褐化劑對山葵組培苗增殖的影響

由圖1可見，除PVP 2.000 g/L處理(B1)外，山葵組培苗從繼代培養(yǎng)第1個月到第3個月，每個處理的增殖系數(shù)呈增加趨勢，第1個月增殖速率相對較快，第2個月相對最快，第3個月趨于緩慢；山葵組培苗繼代培養(yǎng)到第3個月時，PVP、L-半胱氨酸、檸檬酸、維生素C、DTT、AgNO3處理的組培苗增殖系數(shù)多明顯高于對照，而活性炭、Na2S2O3處理的組培苗增殖系數(shù)均明顯低于對照；隨使用濃度的上升，活性炭、Na2S2O3處理的山葵組培苗增殖系數(shù)呈逐漸下降趨勢，說明高濃度活性炭、Na2S2O3使山葵組培苗的增殖分化受到抑制；DTT處理的增殖系數(shù)相對最高，繼代培養(yǎng)第3個月時，0.020 g/L DTT處理的增殖系數(shù)高達6.45；增殖系數(shù)最低的為Na2S2O3處理，Na2S2O310.000 g/L處理時增殖系數(shù)僅為0.20；山葵組培苗繼代培養(yǎng)3個月，不同抗褐化劑處理的組培苗增殖系數(shù)高低依次為DTT>檸檬酸>L-半胱氨酸>AgNO3>PVP>維生素C>清水>活性炭>Na2S2O3。

2.3 不同抗褐化劑對山葵植株生長的影響

由表2可見，山葵組培苗繼代培養(yǎng)到第3個月，活性炭處理的植株長勢相對最好，葉色油綠有光澤，且葉較大，莖稈粗壯，無黃葉出現(xiàn)，其次是PVP、DTT、AgNO3處理；Na2S2O3處理的長勢相對最差，隨試驗濃度的升高，出現(xiàn)大量黃葉，并迅速死亡。試驗發(fā)現(xiàn)，到第3個月時，大部分處理出現(xiàn)黃葉、植株衰老現(xiàn)象，這可能是由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)已不能滿足山葵生長需求，因此，培養(yǎng)到第2個月時是山葵組培苗轉瓶的最佳時機。

表2不同抗褐化劑處理3個月時的山葵生長情況

3 結論與討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，不管是木本植物還是草本植物，褐化現(xiàn)象普遍存在，多數(shù)學者認為這主要是由多酚氧化酶(PPO)作用于其底物酚類物質(zhì)而引起的，PPO催化酚類化合物形成醌和水，醌再經(jīng)非酶促聚合，形成對植物材料產(chǎn)生毒害作用的褐色物質(zhì)[10]。在組織培養(yǎng)過程中，添加抗褐化劑是控制褐化現(xiàn)象發(fā)生的常見方法，而最理想的抗褐化劑是既能控制褐化又不影響植物的正常生長[11]。本試驗發(fā)現(xiàn)，山葵是一種對外界環(huán)境條件較敏感、易褐化的植物，在使用經(jīng)篩選、適宜山葵增殖和生長培養(yǎng)基的基礎上進行抗褐化劑及其使用濃度篩選，以排除不良生長環(huán)境對山葵組培苗的干擾。試驗結果表明，硝酸銀處理的抗褐化效果相對最好，且對山葵增殖和生長有較好的促進作用；活性炭抗褐化效果僅次于AgNO3，且隨試驗濃度升高，抗褐化效果增強，這與郝克偉的研究結果[12]一致；活性炭處理的山葵植株長勢相對最好，莖稈粗壯，葉色油綠有光澤，且隨試驗濃度的升高，植株長勢越來越好，但增殖系數(shù)下降，這與劉真華等的研究結果[13-14]一致，說明活性炭濃度升高在增強植株長勢的同時，也抑制了芽的分化；低濃度維生素C處理的抗褐化效果相對較好，山葵植株長勢良好，但增殖系數(shù)相對較低；DTT處理增殖系數(shù)相對最高，植株長勢較好，低濃度處理有一定的抗褐化效果，但不能完全消除褐化現(xiàn)象；檸檬酸處理增殖系數(shù)相對較高，植株長勢較好，但抗褐化效果一般；PVP處理植株長勢較好，但增殖系數(shù)和抗褐化效果一般；L-半胱氨酸處理增殖系數(shù)相對較高，植株長勢較好，但抗褐化效果相對較差；Na2S2O3處理不僅抗褐化效果相對最差，增殖系數(shù)相對最低，且植株長勢也最差，這與張俊琦等的研究結果[10，15]相似，而與劉真華等的研究結果[13]不一致，這可能是由于研究材料不同或本研究中Na2S2O3使用濃度相對較高所致，低濃度Na2S2O3是否有較好的抗褐化效果還須進一步探索。

同一種抗褐化劑不同濃度之間，雖然濃度梯度相差較小，但抗褐化效果、增殖系數(shù)和長勢之間卻存在很大差異。試驗表明，隨活性炭濃度的升高，抗褐化效果、植株長勢增強，而增殖系數(shù)急劇下降；低濃度L-半胱氨酸、維生素C處理和高濃度處理抗褐化效果差異明顯，低濃度處理取得較好的抗褐化效果，而高濃度處理加重了山葵的褐化程度，但高濃度處理對山葵增殖和生長卻沒有抑制作用，反而有所促進；低濃度Na2S2O3處理加重山葵組培苗的褐化程度，高濃度處理雖未加重其褐化程度，卻出現(xiàn)大部分植株枯黃死亡。因此，為達到抗褐化效果、增殖和長勢之間的平衡，在篩選適宜的抗褐化劑基礎上，明確其適宜濃度必不可少。綜合抗褐化效果、增殖系數(shù)及生長情況，AgNO3處理抗褐化效果相對最好，山葵組培苗增殖系數(shù)相對較高，植株長勢也較好，可作為山葵組培過程中克服褐化產(chǎn)生的理想抗褐化劑，其中0.025 g/L AgNO3處理效果相對最好，山葵組培苗繼代培養(yǎng)3個月時的褐化指數(shù)為0，增殖系數(shù)達到5.22，且莖稈粗壯、葉大、葉色深綠，植株生長狀況良好。

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