黃秋葵水提物的組分及體外抗氧化活性分析

王 華

(河北環(huán)境工程學院，河北秦皇島 066102)

黃秋葵[Abelmoschusesculentus(L.)Moench]為錦葵科秋葵屬一年生草本植物，目前在國內多個地區(qū)均有栽培，其資源較為豐富。黃秋葵嫩果特有黏性物質，富含蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素、多糖、黃酮類化合物等，且營養(yǎng)豐富，黃秋葵還可作為菜、藥、花兼用，具有很高的開發(fā)利用價值和應用前景[1-2]。目前對于黃秋葵功效研究，主要集中在其抑菌作用、抗氧化、抗疲勞、降血糖血脂、保健護胃等方面[3-6]。

自由基作為生命活動的天然中間代謝產物，與生命體損傷、衰老和一些疾病密切相關。因此，天然抗氧化物質清除自由基的能力已經成為體外抗氧化活性研究的熱點[7-9]。已有利用黃秋葵水提物進行抗疲勞與降血糖等相關研究[3-5]，但目前未見對黃秋葵水提物體外抗氧化作用的系統(tǒng)研究報道。本研究以黃秋葵嫩莢的水提物為基礎，通過2種不同干燥方法獲得黃秋葵水提物干品，進行系統(tǒng)的體外抗氧化研究，以期為黃秋葵水提物的綜合利用提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵，購自北京新發(fā)地農產品批發(fā)市場。2，2′-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，Sigma；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma；2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，Sigma；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)，Sigma；2，2′-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(簡稱AAPH)，Sigma；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

2802紫外-可見分光光度計，UNICO公司；XH-C旋渦振蕩儀，金壇市醫(yī)療儀器廠；RE-6000亞榮旋蒸蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱，常州諾基儀器有限公司；EpochTM微孔板分光光度計，美國伯騰儀器有限公司(BioTek)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀，帝肯(上海)貿易有限公司(Tecan Group Ltd)。

1.3 黃秋葵水提物的提取工藝

黃秋葵嫩莢→切片→自然晾干→加水浸泡(加熱攪拌)→過濾→濾液烘干→稱質量。

黃秋葵水提物提取率計算公式：

水提物得率=(水提物質量/黃秋葵鮮質量)×100%。

1.4 測定方法

1.4.1 多糖和總糖測定方法

1.4.1.1 標準曲線的繪制[10]配制0.2 mg/mL葡萄糖標準溶液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖標準溶液，各以水補至2.0 mL，加入6%苯酚1 mL，然后迅速加入5 mL濃硫酸，靜止10 min，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm測定吸光度，用2 mL水按同樣顯色操作作為空白對照，橫坐標為多糖濃度(mg/mL)，縱坐標為吸光度，得到標準曲線。

1.4.1.2 黃秋葵多糖含量的測定 稱取1.00 g黃秋葵水提物，加入100 mL蒸餾水，超聲溶解，然后加入4倍體積的無水乙醇，靜置2 h，離心，烘干。

將黃秋葵粗多糖加入一定體積的蒸餾水中溶解，經適當稀釋后，參照“1.4.1.1”節(jié)標準曲線的制作方法進行樣品中多糖含量的測定。

1.4.1.3 黃秋葵總糖含量的測定 稱取1 g黃秋葵水提物，加入100 mL蒸餾水，超聲溶解，定容至100 mL，取1 mL樣品，稀釋至100 mL，參照“1.4.1.1”節(jié)標準曲線的制作方法進行樣品中總糖含量的測定。

1.4.2 水分含量的測定 參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》。

1.4.3 灰分含量的測定 參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》。

1.4.4 果膠含量的測定 參照NY/T 2016—2011《水果及其制品中果膠含量的測定》。

1.5 抗氧化測定方法

1.5.1 ABTS+·清除能力 參考Li等的方法[11]，分別配制ABTS儲備液(7.4 mmol/L)、K2S2O8儲備液(2.6 mmol/L)、Trolox標準液(0.3 mmol/L)，以及不同濃度的黃秋葵水提物水溶液。取上述ABTS儲備液0.2 mL與K2S2O8儲備液 0.2 mL 混勻，于室溫黑暗處存放12 h，稀釋40～50倍即為ABTS工作液，使其在734 nm處的吸光度為0.7±0.02。取ABTS工作液0.8 mL和樣品0.2 mL，混勻，振蕩10 s，靜置 6 min。以蒸餾水作為空白對照，以Trolox標準液作為陽性對照。ABTS+·清除率計算公式如下：

ABTS+·清除率=[D734 nm(0)-D734 nm]/D734 nm(0)×100%。

式中：D734 nm(0)為空白對照在734 nm處的吸光度。

1.5.2 DPPH自由基清除能力 參考Li等的方法[11]，取 1 mL DPPH乙醇溶液(0.05 mg/mL)，在519 nm處測吸光度(以1.2～1.3最佳)。取2 mL上述DPPH溶液加入試管中，加入1 mL不同濃度的樣品液，混合，靜置30 min，測D519 nm。以蒸餾水作為空白對照，以Trolox標準液作為陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下：

DPPH自由基清除率=[D519 nm(0)-D519 nm]/D519 nm(0)×100%。

式中：D519 nm(0)為空白對照在519 nm處的吸光度。

1.5.3 ·OH清除能力[12]參考文鏡等的方法[12]，稍作改動。清除羥自由基能力參照水楊酸捕捉羥自由基法測定。取9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸溶液各1 mL，加入不同濃度的樣品溶液1 mL與適量蒸餾水，最后加入 1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液后搖勻，37 ℃水浴加熱15 min，測其D593 nm。空白對照溶液為去離子水，參比溶液為不加雙氧水的體系?！H清除率計算公式如下：

·OH清除率={D593 nm(0)-[D593 nm(x)-D593 nm(x0)]}/D593 nm(0)×100%。

式中：D593 nm(0)為空白對照在593 nm處的吸光度；D593 nm(x0)為空白參比溶液在593 nm處的吸光度；D593 nm(x)為樣品參比溶液在593 nm處的吸光度。

式中：ΔD325 nm(0)為空白對照時在300 s與0 s時于325 nm處吸光度的差值；ΔD325 nm(sample)為樣品在300 s與0 s時于 325 nm 處吸光度的差值。

1.5.5 鐵離子還原/抗氧化能力(ferricion reducing atioxidant power，簡稱FRAP) 參考Benzie等的方法[13-14]，稍作修改。取0.3 mL樣品，加2.7 mL預熱至37 ℃的FRAP工作液，搖勻后放置10 min，于593 nm處測其吸光度，以蒸餾水為空白對照。根據(jù)所得D593 nm，在標準曲線上求得相應FeSO4濃度，定義為FRAP值(單位μmol/g，以Trolox計)，其值越大，抗氧化活性越強。以Trolox作為陽性對照。

1.5.6 氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，簡稱ORAC) 參考相關方法[15-16]，取熒光素鈉溶液(80 nmol/L)100 μL于96孔熒光板中，加入不同濃度樣品溶液50 μL振蕩5 min，37 ℃溫育10 min后迅速加入AAPH液(153 mmol/L)50 μL啟動反應，每隔2 min測定1次熒光值(記為Fn，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm)。以Trolox作為陽性對照，計算ORAC值(單位μmol/g，以Trolox計)。

2 結果與分析

2.1 黃秋葵水提物的制備

將10 kg新鮮黃秋葵用自來水清洗后切片(5～10 mm)，自然晾干稱質量得1.28 kg。取干品500 g，料液比 1 g ∶20 mL，95 ℃提取1 h，提取2次，過濾合并濾液，濃縮、干燥后得到173 g，黃秋葵水提物得率為4.43%。

2.2 水提物主要營養(yǎng)成分

由表1可以看出，凍干水提物中功能成分多糖含量高達12.01%，黃酮含量為1.10%，果膠含量為2.0%。在不同干燥條件下，除水分含量，水提物中功能成分含量沒明顯差異。

表1黃秋葵水提物各營養(yǎng)成分(n=3)

2.3 抗氧化能力

2.3.1 ABTS+·清除能力 由圖1可見，當黃秋葵水提物濃度≥0.5 mg/mL時，黃秋葵水提物的ABTS+·清除能力均高于79%，當黃秋葵水提物濃度為0.1 mg/mL時，黃秋葵水提物的ABTS+·清除能力下降了50%。可見黃秋葵水提物的不同干燥方式對ABTS+·清除能力影響不明顯，烘干處理的EC50約為0.2 mg/mL。

2.3.2 DPPH·清除能力 如圖2所示，黃秋葵水提物經烘干后，當濃度達到0.6 mg/mL時，DPPH·清除率達到最大值，黃秋葵烘干水提物的EC50約為2.3 mg/mL；而經凍干的黃秋葵水提物其DPPH·清除率隨著濃度增大而增高，當濃度達到1.0 mg/mL時，DPPH·清除率達到79.1%，黃秋葵凍干水提物的EC50約為0.1 mg/mL。

2.3.3 ·OH清除能力 如圖3所示，黃秋葵水提物干燥后，對·OH清除能力具有一定的濃度依賴關系，隨著濃度增大而增強，凍干處理黃秋葵水提物的EC50約為8.3 mg/mL。

2.3.5 其他抗氧化活性 參考Benzie等方法[13-14]，稍作修改。以FeSO4作為標準品，其標準曲線回歸方程為y=0.002 3x+0.319(r2=0.993)；以Trolox作為陽性對照，其標準曲線回歸方程為y=0.005 9x+0.030 8(r2=0.998)。根據(jù)回歸方程計算，烘干水提物與凍干水提物FRAP如表2所示。在測定水提物FRAP的過程中，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力和濃度有一定量效關系，與李孟秋等的研究結果一致[9]。

參考相關方法[15-16]，以Trolox為陽性對照，其標準曲線回歸方程為y=0.276 6x+15.311(r2=0.991)。根據(jù)回歸方程計算烘干水提物與凍干水提物的ORAC如表2所示，可見水提物總抗過氧化自由基能力ORAC高于常見蔬菜青花菜(總ORAC為168 μmol/g)。

表2黃秋葵水提物FRAP和ORAC(n=3)

3 結論

黃秋葵水提物經熱風烘干或冷凍干燥，在其體外抗氧化性研究中，不同干燥方法對體外抗氧化性有一定影響，干燥方法除對DPPH·清除率與ORAC有明顯影響外，對其抗氧化能力沒有明顯影響。在后續(xù)試驗中，在選取FRAP的測定過程中，發(fā)現(xiàn)其抗氧化能力和濃度有一定量效關系，并且在模擬胃液和腸液代謝研究過程中具有不同的變化規(guī)律，這需要在今后進行系統(tǒng)的研究。

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