王艷麗，陳克云，梁秀清，張紅霞，胡 梅，劉艷明，祝建華

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101)

氟蟲(chóng)腈是一種廣譜殺蟲(chóng)劑，能有效殺死跳蚤、虱子等生物，被世界衛(wèi)生組織列為“對(duì)人類(lèi)有中度毒性”的化學(xué)品。歐盟、美國(guó)和中國(guó)香港對(duì)鮮蛋中氟蟲(chóng)腈的限量要求分別為0.005、0.03、0.02 mg/kg，其中歐盟規(guī)定氟蟲(chóng)腈不得用于人類(lèi)食品產(chǎn)業(yè)鏈的畜禽養(yǎng)殖過(guò)程，且對(duì)所有食品的限量要求均為0.005 mg/kg；國(guó)際食品法典委員會(huì)對(duì)蛋類(lèi)、禽肉類(lèi)和內(nèi)臟中氟蟲(chóng)腈的限量要求分別為0.02、0.01、0.02 mg/kg，但對(duì)氟蟲(chóng)腈代謝物的限量無(wú)明確規(guī)定。我國(guó)自2009年10月1日起禁用氟蟲(chóng)腈，并在GB2763-2016中明確了氟蟲(chóng)腈在谷物、蔬菜中的最大殘留限量，但對(duì)于蛋類(lèi)和禽類(lèi)中的最大殘留限量未做規(guī)定。

歐盟爆發(fā)雞蛋中氟蟲(chóng)腈超標(biāo)的問(wèn)題，短時(shí)間內(nèi)在國(guó)際上引起了廣泛關(guān)注。由于產(chǎn)蛋雞食用了含有氟蟲(chóng)腈成分的飼料，導(dǎo)致雞蛋及其制品、雞肉及其制品存在氟蟲(chóng)腈殘留的風(fēng)險(xiǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法[1-5]、氣相色譜法[6-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8-15]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16]。有關(guān)畜禽肉、蛋及內(nèi)臟中氟蟲(chóng)腈及其代謝物(氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚)殘留的同時(shí)檢測(cè)方法尚無(wú)報(bào)道。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)畜禽肉、蛋及內(nèi)臟中氟蟲(chóng)腈及其代謝物進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，保證了定性定量的準(zhǔn)確性，能夠滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外對(duì)肉、蛋及內(nèi)臟中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ8000Evo氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有EI源(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Agilent7890B-5975A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有CI源、EI源(美國(guó)安捷倫公司)；氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)；高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma)；Milli-Q超純水機(jī)；電子分析天平(北京賽多利斯)；正己烷、乙腈(農(nóng)殘級(jí)，德國(guó)默克公司)；N-丙基-乙二胺吸附劑(PSA粉末，Agela，40～60 μm)；硅膠(C18，Agela，50 μm，60 ?)；石墨化碳黑(GCB，德國(guó)CNW公司)；NaCl(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氟蟲(chóng)腈、氟甲腈(MB46513)、氟蟲(chóng)腈砜(MB46136)、氟蟲(chóng)腈硫醚(MB45950)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(國(guó)家農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究檢測(cè)所)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：將液體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用丙酮-正己烷(3∶7)稀釋成 10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存，有效期為3個(gè)月。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：量取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)需要用陰性樣品提取凈化后的溶液稀釋成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

樣品預(yù)處理：樣品經(jīng)食品粉碎機(jī)充分粉碎混勻，制備好的試樣裝入潔凈容器內(nèi)，于4 ℃冰箱中保存。

提?。悍Q(chēng)取5.00 g已粉碎的樣品至50 mL離心管中，加5 mL水，渦旋1 min，再加20 mL乙腈，渦旋2 min，超聲20 min；加4 g氯化鈉，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min。

凈化：取上清液12 mL至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈飽和的正己烷除脂，棄去正己烷層。對(duì)于豬肉提取液，加入250 mg PSA和250 mg C18進(jìn)行凈化；對(duì)于雞蛋、雞肉、內(nèi)臟，加入250 mg PSA、250 mg C18和100 mg GCB凈化。取10 mL凈化液氮吹至近干，1 mL丙酮-正己烷(3∶7)定容，過(guò)膜，待測(cè)。

1.4 儀器條件

1.4.1氣相色譜條件色譜柱為T(mén)R-35MS(30 m×250 μm×0.25 μm，美國(guó)Thermo公司)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度90 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；載氣:高純氦氣(99.999%)，恒定流速：1 mL/min。

1.4.2質(zhì)譜條件EI源質(zhì)譜條件：傳輸線溫度:280 ℃，離子源溫度：300 ℃；四極桿溫度：180 ℃；電離能量:70 eV；溶劑延遲：7 min；監(jiān)測(cè)方式：SIM模式。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的選擇離子見(jiàn)表1。

NCI源質(zhì)譜條件：反應(yīng)氣為甲烷(純度≥99.99%)，40%流量。離子源和四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電離能量：70 eV；溶劑延遲：7 min；監(jiān)測(cè)方式：SIM模式。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的選擇離子見(jiàn)表1。

表1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的GC-MS質(zhì)譜信息Table 1 MS information for fipronil and its metabolites

*quantitative ion

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜條件：電子轟擊離子(EI)源，電離能量為70 eV，離子源溫度為300 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；掃描模式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)；溶劑延遲時(shí)間為7 min。4種待測(cè)組分的母離子、特征離子碎片及其碰撞電壓見(jiàn)表2。

表2 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的GC-MS/MS信息Table 2 GC-MS/MS information of fipronil and its metabolites

*quantitative ions

圖1 不同用量PSA與C18凈化的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of different amounts of PSA and C181:50 mg+50 mg；2:100 mg+100 mg；3:250 mg+ 250 mg；4:500 mg+500 mg

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

雞蛋、雞肉、雞肝、豬肉和豬腎等樣品含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，由于乙腈的極性強(qiáng)，能較少地提取脂肪并具有沉淀蛋白的作用，因此選用乙腈作為提取液。PSA和C18混用可有效去除脂肪、碳水化合物等雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了PSA和C18的用量，通過(guò)TIC圖(圖1)比較，發(fā)現(xiàn)選用250 mg PSA和250 mg C18時(shí)，雜質(zhì)最少。對(duì)于雞蛋、雞肉及內(nèi)臟等樣品，提取液中需加入適量GCB以?xún)艋?。?shí)驗(yàn)比較了不同用量GCB的凈化效果，發(fā)現(xiàn)不加GCB時(shí)在目標(biāo)物出峰時(shí)間段內(nèi)雜質(zhì)峰響應(yīng)較高；當(dāng)加入100 mg和200 mg GCB時(shí)，雜質(zhì)峰響應(yīng)相差不大。另外通過(guò)比較目標(biāo)物的回收率，發(fā)現(xiàn)加入不同量的凈化劑時(shí)目標(biāo)物的損失差別不大，因此最終選用250 mg PSA、250 mg C18和100 mg GCB進(jìn)行凈化。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

由于氟蟲(chóng)腈及其代謝物含有多個(gè)鹵原子，故選擇適用于只對(duì)含電負(fù)性元素化合物有響應(yīng)的NCI源進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，而用NCI源方法得到的雞蛋陰性樣品的譜圖非常干凈；而用EI源得到的譜圖，不論是單極質(zhì)譜還是串聯(lián)質(zhì)譜，均在目標(biāo)峰附近出現(xiàn)雜質(zhì)峰。因此，GC-MS/NCI的選擇性?xún)?yōu)于GC-MS/EI和GC-MS/MS/EI。

2.3 線性范圍、方法檢出限及定量下限

為消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)采用空白樣品提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“1.3”條件進(jìn)行測(cè)定，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子監(jiān)測(cè)圖見(jiàn)圖2。以各組分的定量離子峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，其質(zhì)量濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種組分的線性方程及相關(guān)系數(shù)(r2)。在優(yōu)化色譜條件下，通過(guò)空白樣品加標(biāo)試驗(yàn)確定方法的檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，在0.001～2.0 mg/L范圍內(nèi)，各目標(biāo)物呈良好的線性關(guān)系。另外，通過(guò)比較表3中檢出限和定量下限數(shù)據(jù)可以看出，NCI的靈敏度最高。

表3 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/ L)在不同模式下的選擇離子監(jiān)測(cè)圖
Fig.2 SIM chromatograms of standards mixture(100 μg/ L) obtained under the different modes
A.GC-MS/EI-SIM，B.GC-MS/NCI-SIM,C.GC-MS/MS/EI-SIM;1.fipronil desulfinyl；2.fipronil sulfide；3.fipronil；4.fipronil sulfone

2.4 精密度與回收率

稱(chēng)取不含目標(biāo)物的雞蛋、雞肝、豬肉、豬腎，分別添加2、50、500 μg/kg 3個(gè)濃度水平的氟蟲(chóng)腈及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按所建立的方法進(jìn)行前處理及GC-MS測(cè)定。每份樣品平行測(cè)定6次，考察方法的回收率和精密度。測(cè)得GC-MS/NCI、GC-MS/EI和GC-MS/MS/EI方法的回收率為80.0%～108.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%～7.6%，可見(jiàn)該方法具有較好的可靠性。3種方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表4～6。

表4 GC-MS/NCI法測(cè)定氟蟲(chóng)腈及其代謝物的平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of fipronil and its metabolites in GC-MS/NCI(n=6)

(續(xù)表4)

表5 GC-MS/EI法測(cè)定氟蟲(chóng)腈及其代謝物的平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 5 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of fipronil and its metabolites in GC-MS/EI(n=6)

表6 GC-MS/MS/EI法測(cè)定氟蟲(chóng)腈及其代謝物的平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 6 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of fipronil and its metabolites in GC-MS/MS/EI(n=6)

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

表7 雞蛋中氟蟲(chóng)腈砜的測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 7 Analytical results of fipronil sulfone in eggs(n=3)

從市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)30份雞蛋、雞肉、豬肉、雞肝、豬腎樣品，利用本方法對(duì)樣品中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物進(jìn)行檢測(cè)。有5批雞蛋樣品檢出氟蟲(chóng)腈砜，檢出值為0.009～0.099 mg/kg。應(yīng)用所建立的3種方法分別對(duì)5批次雞蛋樣品中的氟蟲(chóng)腈砜含量進(jìn)行測(cè)定和比較，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表7，3種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致。圖3為檢出氟蟲(chóng)腈砜的陽(yáng)性雞蛋樣品使用3種方法檢測(cè)得到的TIC圖。

3 結(jié) 論

本文建立了GC-MS/EI、GC-MS/NCI和GC-MS/MS/EI 3種技術(shù)測(cè)定動(dòng)物源性食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法，并對(duì)3種技術(shù)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，3種方法均簡(jiǎn)單快捷，準(zhǔn)確度和精密度高，且具有較高的靈敏度，均能滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物的限量要求。3種方法均無(wú)干擾，但NCI法明顯比EI法靈敏度高。3種方法相互補(bǔ)充確證，可有效提高定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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