孫 健，胡 青，張 甦，馮 睿，于 泓，張靜嫻，諸艷蓉，毛秀紅，季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

隨著生活水平的提高，我國抗疲勞類保健食品市場銷量與日俱增。但少數(shù)違法分子為了突出功效、吸引消費者，牟取暴利，在產(chǎn)品中非法添加短期內(nèi)見效快、成本相對低廉的壯陽類化學(xué)藥物。非法添加的壯陽類藥物主要是以西地那非等為代表的磷酸二酯酶5(PDE-5)抑制劑類化合物。目前上市的PDE-5抑制劑主要有西地那非、伐地那非、他達拉非、阿伐那非、烏地那非、米羅那非、歐迪那非[1]。

非法添加該類化合物將給消費者帶來嚴重的健康威脅，其不良反應(yīng)主要表現(xiàn)在中樞神經(jīng)、循環(huán)和視覺系統(tǒng)，較為嚴重不良反應(yīng)為心律失常、心肌梗死、心臟猝死、腦血管出血、高血壓等[2]。

該類化合物的檢測多采用高效液相色譜法[3-5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，質(zhì)譜可采用三重四極桿[6-7]、飛行時間[8-10]、靜電場軌道阱[11]、原位電離[12-14]等技術(shù)。其中，飛行時間質(zhì)譜和靜電場軌道阱質(zhì)譜為高分辨質(zhì)譜，可進行定性篩查和未知物結(jié)構(gòu)確證；原位電離技術(shù)主要用于快速篩查；三重四極桿質(zhì)譜定量相對準確，操作簡便，適合基層檢測機構(gòu)使用。另外，采用近紅外光譜[15]、拉曼光譜[16]、核磁共振法[17]、離子遷移譜法[18]檢測西地那非等1～7種常見壯陽類化合物的研究亦有報道。

目前，我國有4項相關(guān)檢測標準。國家藥品補充檢驗方法和檢驗項目批準件2009030、食藥監(jiān)食監(jiān)三[2016]28號文附件7和國家食品補充檢驗方法BJS201601[19]均采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定了11個化合物(西地那非、他達拉非、伐地那非、紅地那非、那紅地那非、羥基豪莫西地那非、豪莫西地那非、氨基他達拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非)。由本研究團隊牽頭起草的國家食品補充檢驗方法BJS 201704補充檢測了去甲基他達拉非、硫代西地那非[20-21]。但隨著新型衍生物的不斷出現(xiàn)，如近年來國內(nèi)報道的化合物丙氧基苯基西地那非(Propoxyphenyl sildenafil)[22]、丙氧基苯基艾地那非(Propoxyphenyl aildenafil)[23]、丙氧基苯基硫代艾地那非(Propoxyphenyl thioaildenafil)、艾地那非、羥基硫代豪莫西地那非[24]、甲羥基豪莫西地那非[25]、2-羥乙基去甲他達拉菲(2-Hydroxyethylnortadalafil)[26]等。因此，上述標準已不能有效打擊此類新型衍生物的違法添加行為，且衍生物多缺乏系統(tǒng)全面的藥理毒理學(xué)以及臨床研究，其濫用可能會帶來更嚴重的后果。

多數(shù)文獻方法檢測的化合物較少，一般測定10種以下。僅文獻[7]同時測定了17種壯陽類化合物，但化合物種類仍不夠全面，且回收率等方法學(xué)驗證未嚴格按照GB/T27404-2008[27]進行。其他檢測20種以上化合物的方法[8,10]均采用高分辨質(zhì)譜，側(cè)重于定性篩查。本文選擇日常監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)的易被添加的30種化合物作為檢測指標，建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法進行測定，該方法定性定量準確，操作簡便，適用于基層檢測機構(gòu)，可為國家標準的建立提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290/6495超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀；Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)。30種對照品的來源及相關(guān)信息見表1；乙腈、甲酸(色譜純，Merck公司)；甲醇(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

表1 30種化合物的對照品信息Table 1 Information of the 30 reference compounds

(續(xù)表1)

1.2 分析條件

色譜柱：Waters CORTECS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～15 min，95%～2%A；15～18 min，2%A；流速：0.3 mL/min，進樣量：1 μL。

離子源：電噴霧離子(ESI)源，正離子模式；離子源溫度：200 ℃；毛細管電壓：4 000 V；干燥氣流量：12 L/min；霧化氣壓力：25 psi；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：10 L/min；噴嘴電壓：500 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測。30種化合物的母離子、子離子和碰撞能量(CE)見表2。

表2 30種化合物的母離子、子離子、碰撞能量和線性關(guān)系Table 2 Precursor ions,product ions，collision energies(CEs) and linearationship of 30 compounds

*quantitative ion

1.3 對照品溶液的制備

分別取30種對照品適量，精密稱定，用甲醇或空白基質(zhì)提取液溶解并配制成質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/L的系列混合對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備

1.4.1固體樣品取適量固體樣品，混勻，研細，準確稱取1.0 g粉末，置于具塞試管中，加入10 mL甲醇，密塞，稱重，超聲提取10 min，放冷至室溫后，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，根據(jù)實際濃度適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)，作為供試品溶液。

1.4.2液體樣品取適量液體樣品，混勻，準確量取1.0 mL，置于具塞試管中，加入9 mL甲醇，密塞，稱重，超聲提取10 min，放冷至室溫后，再次稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，離心，取上清液，根據(jù)實際濃度適當(dāng)稀釋至線性范圍內(nèi)，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

因本方法中待測化合物均為正離子模式采集，故在流動相中添加0.1%甲酸，以增加正離子的響應(yīng)信號。采用梯度洗脫，流動相條件優(yōu)化后可將豪莫西地那非、艾地那非、丙氧基苯基西地那非和硫代豪莫西地那非、硫代艾地那非兩組同分異構(gòu)體有效分離。

比較了Waters CORTECS T3(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)色譜柱對待測化合物的分離效果及回收率，結(jié)果均可滿足分析儀器的要求?？紤]到保健食品的基質(zhì)均較復(fù)雜，對色譜柱的使用壽命有一定要求，而后者進行復(fù)雜基質(zhì)檢測時，色譜柱壽命不如前者，故最終選擇Waters CORTECS T3(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)色譜柱對待測化合物進行分離。另外，考慮到保健品基質(zhì)復(fù)雜，強保留成分多，因此待所有組分全部出峰后，采用高比例有機相充分清洗色譜柱，以避免殘留基質(zhì)對后續(xù)樣品的影響。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

30種化合物的電噴霧離子化效果均較好，故采用電噴霧離子化源進行分析。分別用甲醇溶解30種化合物，配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的對照品溶液，采用Agilent MassHunter Optimizer軟件自動優(yōu)化質(zhì)譜條件，使用單針自動進樣分析目標化合物,在正離子模式下進行全掃描,確定30種化合物的分子離子,將分子離子作為母離子,施加一定的碰撞能量,全掃描二級離子,選取豐度較高的2個子離子分別作為定量和定性離子,以MRM模式優(yōu)化碰撞能量(V)、碎裂電壓(V)等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化條件下，30種化合物的MRM色譜圖見圖1。

圖1 30種化合物的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of 30 compouds

2.3 供試品溶液的制備考察

對比了甲醇和乙腈作為提取溶劑時對30種化合物的提取效果，結(jié)果表明乙腈與甲醇的提取結(jié)果基本一致，但30種化合物在甲醇中的溶解性較好，綜合考慮成本、試劑毒性等因素，最終確定甲醇為提取試劑。

以保健酒為例對前處理進行研究，比較了Waters Prime HLB固相萃取柱凈化方法(圖2中Method 1)和甲醇直接超聲提取(圖2中Method 2)的實驗效果。結(jié)果顯示，HLB固相萃取柱凈化方法的回收率與甲醇直接超聲提取相差不大。因甲醇超聲提取操作簡便，最終確定其為前處理方法。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

以保健酒為例考察基質(zhì)效應(yīng)，研究顯示，采用溶劑甲醇配制標準曲線時，8種化合物的回收率低于80%，偏差較大，基質(zhì)效應(yīng)嚴重。故采用空白基質(zhì)提取液，配制基質(zhì)對照品溶液(圖2中Method 3)。結(jié)果表明，以空白基質(zhì)配制標準曲線可使多數(shù)化合物的回收率得到明顯改善，僅那紅地那非和紅地那非的回收率低于80%。

圖2 樣品前處理和基質(zhì)效應(yīng)的考察Fig.2 Study of sample preparation and matrix effectthe numbers denoted were the same as those in Table 1

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1線性關(guān)系在上述優(yōu)化條件下，對系列混合對照品溶液進樣分析，以化合物的峰面積(y)為縱坐標，對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標進行線性回歸，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，30種化合物在10～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。

2.5.2專屬性選擇牡蠣片和保健酒2種基質(zhì)作為固態(tài)和液態(tài)保健食品的代表基質(zhì)。取牡蠣片和保健酒2種空白基質(zhì)，按供試品溶液制備方法配制空白溶液，進樣分析，結(jié)果均未檢出該30種化合物。

2.5.3加標回收率及精密度取上述2種基質(zhì)，分別添加低(0.1 mg/kg)、中(0.2 mg/kg)、高(1.0 mg/kg) 3個水平的對照品溶液，每個水平做6個平行樣，按上述供試品溶液制備方法和色譜-質(zhì)譜條件進行分析，計算加標回收率和相對標準偏差(見表3)。30種化合物的平均加標回收率為62.8%～135.2%，RSD均不大于14%。液體基質(zhì)中僅那紅地那非和紅地那非的回收率低于80%；固體基質(zhì)中僅氨基他達拉非的回收率低于80%，硫代艾地那非的回收率大于120%；其余26種化合物的回收率及精密度均符合GB/T 27404-2008(實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測)要求。

表3 30種化合物的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 30 compounds(n=6)

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

2.5.4檢出限與定量下限向基質(zhì)中添加0.05 mg/kg的30種化合物，以能實際檢出的最低含量作為檢出限(LOD)，以回收率符合要求的最低含量作為定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，30種化合物的LOD為0.05 mg/kg(固體)或0.05 mg/L(液體)，LOQ為0.1 mg/kg(固體)或0.1 mg/L(液體)。

他達拉非、西地那非的臨床用量分別為10 mg/次和50 mg/次。以每次服用保健食品1 g計，起效非法添加的含量分別為10 mg/g和50 mg/g，本方法的檢出限和定量下限可滿足日常非法添加劑量檢測的監(jiān)管需求。

2.6 定性判斷方法

保健食品中添加的化學(xué)藥品為禁用物質(zhì)，測定方法應(yīng)首先確保定性準確。本課題組已建立了31種壯陽類化合物的Q-TOF高分辨質(zhì)譜篩查方法[8]，但受限于基層實驗室儀器、人員等因素，方法推廣不易，且監(jiān)管方時常需要定量結(jié)果。故本研究采用易于標準化操作的三重四極桿質(zhì)譜建立測定方法，同時兼顧定性定量的準確性。

根據(jù)歐盟SANCO/12571/2013的規(guī)定，三重四極桿方法確證化合物至少需要兩個子離子，且濃度相當(dāng)?shù)墓┰嚻啡芤汉蜆藴嗜芤合鄬﹄x子豐度一致(相對比例>50%，允許±20%偏差；相對比例>20%～50%，允許±25%偏差；相對比例>10%～20%，允許±30%偏差；相對比例≤10%，允許±50%偏差)。

2.7 實際樣品的測定

表4 實際樣品的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of real samples

表4列出了保健食品中非法添加化學(xué)藥品實際檢測工作中兩百余批涉案專項陽性樣品的檢測結(jié)果。結(jié)果表明，添加化合物主要為西地那非和他達拉非，亦存在同時添加多種化合物的現(xiàn)象，且含量差異較大，安全風(fēng)險高。

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定30種壯陽類化合物的分析方法，增加了現(xiàn)有國家標準中檢測化合物的種類，定性定量準確，操作簡便，已應(yīng)用于實際樣品檢測，可為國家標準的建立提供參考。

參考文獻：

[1] Feng J,Zhu S X,Xu S W,Shi Y.Chin.J.Pharm.(馮金，朱少璇，許淑文，石瑛.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志),2016,47(8):1085-1092.

[2] Yu Q B,Xu L,Xiao Z M.HeraldofMedicine(余慶斌，徐玲，肖志梅.醫(yī)藥導(dǎo)報),2012,31(7):959-961.

[3] Xing J B,Cao H,Zhang J,Shan T T,Shui C H,Chen Y M,Hu D.LishizhenMed.Mater.Med.Res.(邢俊波，曹紅，張炯，單婷婷，水彩紅，陳玉梅，胡丹.時珍國醫(yī)國藥),2014,25(2):451-453.

[4] Lei Y,Huang Y T,Chen L,Zhang R.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(雷毅，黃艷婷，陳林，張榮.理化檢驗：化學(xué)分冊),2016,52(3):249-254.

[5] Lei Y,Huang Y T,Luo Z Y.Phys.Test.Chem.Anal.:Chem.Anal.(雷毅，黃艷婷，羅卓雅.理化檢驗：化學(xué)分冊),2014,50(5):530-535.

[6] Zhang J,Ding T,Liu Y,Lü C,Fei X Q,Shen C Y,Wu B,Zhang R,Guo L,Ji M Q,Wang X L,Huang Z Q.Environ.Chem.(張健，丁濤，劉蕓，呂辰，費曉慶，沈崇鈺，吳斌，張睿，郭玲，季美泉，王栩璐，黃志強.環(huán)境化學(xué)),2016,35(2):415-418.

[7] Huang F,Wu H Q,Huang X L,Luo H T,Zhu Z X,Lin X S,Ma L G,Jiang Y L.Chin.J.Chromatogr.(黃芳，吳惠勤，黃曉蘭，羅輝泰，朱志鑫，林曉珊，馬立果，蔣婭蘭.色譜),2016,34(3):270-278.

[8] Yu H,Hu Q,Zhang S,Sun J,Feng R,Ji S.Chin.Pharm.J.(于泓，胡青，張甦，孫健，馮睿，季申.中國藥學(xué)雜志),2013,48(15):1312-1318.

[9] Hu T T,Qu X Y,Kang M Q,Song Q L,Yang L,Zhao Y H,Zhang D H.Chin.J.Chromatogr.( 胡婷婷，曲曉宇，康明芹，宋清蓮，楊璐，趙韞慧，張代輝.色譜),2015,33(8):897-901.

[10] Wang M L,Zeng L,Yan H F,Li Y J,Dai H.J.Instrum.Anal.(王美玲,曾樂，顏鴻飛，李擁軍，戴華.分析測試學(xué)報),2014,33(3):239-247.

[11] Liu Y,Ding T,Liao X Q,Shen C Y,Jiang S,Lü C,Gui Q W,Liu H,Fei X Q,Wu B,Zhang R,Wang Y,Ji M Q,Wang X L,Huang Z Q.Chin.J.Anal.Chem.(劉蕓，丁濤，廖雪晴，沈崇鈺，姜珊，呂辰，桂茜雯，柳菡，費曉慶，吳斌，張睿，王艷，季美泉，王栩璐，黃志強.分析化學(xué)),2016,44(3):423-429.

[12] Cheng X L,Li W J,Li W J,Wei F,Xiao X Y,Lin R C.Chin.J.Pharm.Anal.(程顯隆，李文杰，李衛(wèi)健，魏鋒，肖新月，林瑞超.藥物分析雜志),2011,31(3):438-442.

[13] Wu S,Wang H,Zhu H G,Zhao Y,Tian Q Q,Sun W J,Ding L,Chen B.Chin.J.Anal.Chem.(吳雙，王華，朱慧果,趙勇，田清青，孫文劍，丁力，陳波.分析化學(xué)),2012,40(7):1081-1085.

[14] Wan P,Lu Y H,Chen B.Chin.J.FoodHyg.(萬萍，盧岳華，陳波.中國食品衛(wèi)生雜志),2017,29(4):459-463.

[15] Wang X L,Feng Y C,Hu C Q.Chin.J.Anal.Chem.(王學(xué)良，馮艷春，胡昌勤.分析化學(xué)),2009,37(12):1825-1828.

[16] Wang Y,Cao L,Luo J N.Chin.Pharm.J.(王玉，曹玲，羅疆南.中國藥學(xué)雜志),2011,46(10):789-793.

[17] Zhang Z Q,Wang L J,An D G,Tu G Z,Zhao Y.J.Instrum.Anal.(張志強，王麗娟，安東各，涂光忠，趙陽.分析測試學(xué)報),2017,36(2):257-261.

[18] Feng X,Yin L H,Jin S H,Zhu L.Chin.J.Pharm.Anal.(馮雪，尹利輝，金少鴻，朱俐.藥物分析雜志),2016,36(2):313-320.

[19] China Food and Drug Administration.No.196 Bulletin of the China Food and Drug Administration.2016(國家食品藥品監(jiān)督管理總局.總局公告2016年第196號).[2016-12-26].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1830/167963.html.

[20] China Food and Drug Administration.No.48 Bulletin of the China Food and Drug Administration.2017(國家食品藥品監(jiān)督管理總局.總局公告2017年第48號).[2017-05-05].http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1830/172345.html.

[21] Jin S M,Gao W C,Ning X,Cao J,Ding H.J.FoodSaf.Qual.(金紹明，高文超，寧霄，曹進，丁宏.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報),2017,8(7):2448-2452.

[22] Sun J,Yu H,Hu Q,Feng R,Zhang S,Ji S.ActaPharm.Sin.(孫健，于泓，胡青，馮睿，張甦，季申.藥學(xué)學(xué)報),2014,49(4):513-516.

[23] Zhou J L,Zhou Z,Chen B L,Ma L K.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(周建良，周哲，陳碧蓮，馬臨科.質(zhì)譜學(xué)報),2016,37(5):422-430.

[24] Duan Q,Ma C Y,Feng S H.Chin.J.Pharm.Anal.(段瓊，馬春艷，封淑華.藥物分析雜志),2017,37(2):277-282.

[25] Huang C H,Cai D D,Chen Z Y.Chin.J.Pharm.Anal.(黃朝輝，蔡丹丹，陳仲益.藥物分析雜志),2015,35(4):694-698.

[26] Feng R,Yu H,Sun J,Hu Q,Zhang S,Mao X H,Ji S.J.FoodSaf.Qual.(馮睿，于泓，孫健，胡青，張甦，毛秀紅，季申.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報),2016,7(7):2710-2714.

[27] GB/T 27404-2008.Criterion on Quality Control of Laboratories——Chemical Testing of Food.National Standards of the People′s Republic of China(實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測.中華人民共和國國家標準).