不同DNA提取方法對(duì)肺癌血漿循環(huán)DNA抽提效果比較

李旺勝 唐一通 張楚微 王書菲 徐洲 杜陳 金釗

摘要：目的：研究不同DNA抽提方法對(duì)肺癌血漿循環(huán)DNA的提取效果。方法：選取68例肺癌患者為研究對(duì)象，比較GenMagBio磁珠法、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒方法、苯酚-氯仿法對(duì)肺癌血漿循環(huán)DNA的提取效果。結(jié)果：幾種方法中，磁珠法具有最高的提取效率和最低的CV值。結(jié)論：磁珠法對(duì)肺癌血漿循環(huán)DNA具有最好的抽提效果，適合于對(duì)小片段DNA的提取。

關(guān)鍵詞：肺癌；循環(huán)DNA；抽提方法

中圖分類號(hào)：G642.423 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2018）11-0274-02

循環(huán)DNA是存在于人和動(dòng)物體液中的胞外DNA分子。研究表明，健康人群循環(huán)DNA含量極低（約5 μg/L左右）。當(dāng)機(jī)體在炎癥、自身免疫病和腫瘤等情況下，其在體液中的含量會(huì)大大增加，機(jī)制至今仍不明確。因?yàn)檠h(huán)DNA與包括腫瘤在內(nèi)的一些疾病的產(chǎn)生與發(fā)展密切相關(guān)，所以其對(duì)于腫瘤等疾病的早期診斷和療效評(píng)價(jià)具有重要的臨床意義。本文分別采用不同的DNA提取方法對(duì)肺癌患者的血漿循環(huán)DNA進(jìn)行抽提，其結(jié)果報(bào)告如下。

一、資料與方法

1.一般資料：以2016年9月—2017年4月的68例肺癌患者為研究對(duì)象，其中男43例，女25例，平均年齡（58.2±4.6）歲。

2.方法：所有肺癌患者取靜脈血5ml置于EDTA抗凝管中，以3000r/min，離心10min吸取上清血漿于凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆?。分別參照試劑盒及文獻(xiàn)報(bào)道方法用血清游離DNA提取試劑盒（北京金麥格生物技術(shù)有限公司）、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Sangon Biotech）、苯酚-氯仿法對(duì)肺癌血漿循環(huán)DNA進(jìn)行提取。選取K-ras基因?yàn)槟繕?biāo)基因，并設(shè)計(jì)擴(kuò)增探針（Forward primer：5'-ATTAAAAGGTACTGGTGGAG-3'；Reverse primer：5'-CTATTGTTGGATCATATTCG-3'），對(duì)三種抽提方法所得循環(huán)DNA樣本K-ras基因外顯子2基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：模板5 μL，擴(kuò)增引物各2.5 μL ，Taq PCRm mastermix 10 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 40 S，43℃ 40 S，72℃ 40 S；40 循環(huán)，72 ℃ 3 min。以血清游離DNA提取試劑盒（磁珠法）提取循環(huán)DNA模板擴(kuò)增條帶為參照，用BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定其他兩種方法對(duì)應(yīng)擴(kuò)增條帶相對(duì)亮度比值，用以比較三種方法對(duì)循環(huán)DNA的抽提效果。選取同一血漿樣本，三種方法分別重復(fù)提取5次，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較不同方法擴(kuò)增條帶亮度差異情況，計(jì)算各方法的變異系數(shù)（CV）。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS14.0進(jìn)行，多個(gè)樣本的比較采用x2檢驗(yàn)。

二、結(jié)果

1.提取效率的比較。三種提取方法中，磁珠法對(duì)應(yīng)泳道擴(kuò)增條帶亮度最大，SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒方法次之，苯酚-氯仿法最弱（見(jiàn)圖1）。SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒方法和苯酚-氯仿法與磁珠法相比，其提取效率分別為67%%和49%（P<0.01）。因此，三種方法中，磁珠法具有最高的提取效率，見(jiàn)表1。

2.三種方法抽提循環(huán)DNA重復(fù)性比較：通過(guò)比較各方法5次PCR擴(kuò)增條帶亮度差異值，磁珠方法的變異系數(shù)（CV）小于其他兩種方法，說(shuō)明磁珠法的重復(fù)性好，其他兩種方法較差（P<0.01），見(jiàn)表1。

三、討論

外周血循環(huán)DNA來(lái)自于腫瘤細(xì)胞的壞死和脫落，研究表明，肺癌腫瘤患者外周血循環(huán)DNA含量顯著高于正常人，并且在基因遺傳性上與腫瘤原發(fā)組織具有高度的一致性[1，2]。提示循環(huán)DNA可為肺癌篩查、診斷及預(yù)后檢測(cè)提供微創(chuàng)、方便的標(biāo)本來(lái)源及檢測(cè)對(duì)象。

Szpechcinski等[3]分別對(duì)16例健康成人和30例未經(jīng)治療的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者循環(huán)DNA進(jìn)行定量研究，結(jié)果顯示，健康人循環(huán)DNA含量為0.9—7.0ng/mL，而NSCLC患者的范圍為1.5—50ng/mL，提示非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)DNA含量大大增加，表明其作為一種腫瘤標(biāo)志物具有重要意義。也有報(bào)道指出循環(huán)DNA的定量對(duì)于肺癌的分期、化療監(jiān)測(cè)等有著重要的意義，可作為腫瘤臨床治療的一種依據(jù)[4]。

近年來(lái)，把基因突變與肺癌的臨床治療相結(jié)合，開展EGFR、Kras等腫瘤標(biāo)記基因個(gè)體化用藥檢測(cè)的研究得到快速發(fā)展[5，6]。王開云等[7]報(bào)道非小細(xì)胞肺癌患者血清循環(huán)DNA檢測(cè)EGFR基因突變與腫瘤組織檢測(cè)具有高度的一致性，對(duì)肺癌患者的診斷、篩查和治療有著重要的意義。

由于血清中循環(huán)DNA含量極低，并且具有小片段的特征，因此，在提取時(shí)容易丟失，從而影響檢測(cè)的靈敏度?？煽坑行У难h(huán)DNA提取方法對(duì)研究結(jié)果影響很大。本文通過(guò)對(duì)幾種提取方法的提取效果比較顯示，磁珠法具有最高的提取效率和最低的CV值，認(rèn)為磁珠法對(duì)乳腺癌患者血清循環(huán)DNA的提取效果最好，尤其適用于小片斷DNA的提取。

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