曹曉琴，張濤，施璐，房輝，陳中強，方振峰

(江漢大學 醫(yī)學院，湖北 武漢，430056)

煙曲霉是侵襲性曲霉病(inva-siveaspergillosis，IA)最常見的病原菌，可產(chǎn)生多種免疫抑制性真菌毒素。膠霉毒素是煙曲霉產(chǎn)生的真菌毒素之一，是其重要的毒力因子，對人和一些哺乳動物細胞具有免疫抑制及促凋亡作用。關于膠霉毒素的毒害作用，報道主要集中在侵襲性曲霉病患者血清中[1]。周萬青等[2]報道在侵襲性曲霉病動物模型和臨床確診患者血清中均可檢測到膠霉毒素，預示其可作為曲霉病診斷指標。LEWIS等[3]采用LC-MS/MS方法檢測了早期的侵襲性曲霉病人中的膠霉毒素的含量，推測檢測膠霉毒素可作為診斷侵襲性曲霉病的一種新型方法。CERQUEIRA等[4]也采用LC-MS/MS方法檢測了侵襲性曲霉病人中的膠霉毒素的含量。一些研究發(fā)現(xiàn)，食品和飼料中也有可能存在威脅人類和動物健康的膠霉毒素，如KOSALEC等[5]發(fā)現(xiàn)膠霉毒素可產(chǎn)生于玉米的貯存過程中，也存在于豬、牛等動物的飼料中。PENA等[6]證實膠霉毒素還存在于空氣和灰塵中。所以對食品和飼料中的膠霉毒素進行殘留檢測很有必要。本文采用加壓溶劑萃取技術(pressurized liquid extraction，PLE)結合全自動固相萃取技術(automated solid phase extraction，ASPE)對多種食品和飼料基質進行處理，HPLC-MS/MS檢測，建立了多種食品和飼料中膠霉毒素的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

膠霉毒素標準品(純度≥97%)，購自美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈(色譜純)，正己烷、NaOH、HCl(分析純)，購于國藥集團化學試劑有限公司；Oasis HLB柱(60 mg，3 mL),購于美國Waters公司；Mycosep 226真菌毒素凈化柱(5 mL),購于奧地利Romer Labs公司；Bond Elut Mycotoxin柱(500 mg，3 mL),購于美國Varian公司。

玉米、小麥、豬飼料(主要成分為玉米、大豆、魚粉)和雞飼料(主要成分為玉米、豆粕、麩皮)等樣品購于江漢大學農(nóng)貿(mào)市場，樣品先粉碎，然后常溫保存。豬肌肉和肝臟的樣品采購于武漢家樂福超市，樣品先絞碎，然后勻漿，-20 ℃冰箱中保存。

1.2 儀器與設備

HPLC-MS/MS中MS/MS部分(API 4500 triple-quadrupole)，美國Applied Biosystems公司;HPLC部分(LC-30AD和SIL-30AC)，日本Shimadzu公司；加壓溶劑萃取(PLE)設備(Dionex ASE 200)，美國Sunnyvale公司；全自動固相萃取(ASPE)設備(Gilson Aspec XL4)，英國Anachem公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex 100 RP-18(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)(Phenomenex, USA)；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相：乙腈/0.5%乙酸水溶液(50/50，V/V)，流速：0.2 mL/min；洗脫時間：5 min。

1.3.2 質譜條件

電離方式：ESI源(+)；碰撞氣(CAD)：6 psi；氣簾氣(CUR)：20 psi；霧化氣(GS1)：60 psi;輔助氣(GS2):55 psi；離子噴霧電壓(IS)：5 500 psi；離子源溫度(TEM)：550 ℃。膠霉毒素的母離子和子離子條件見表1。

表1 膠霉毒素母離子/子離子信息Table 1 Precursor/daughter ions information of gliotoxin

注：加“*”的離子用于定量。

1.3.3 前處理條件

參考文獻[7]、[8]中報道的方法，采用加壓溶劑萃取(PLE)設備提取。取玉米、小麥及飼料樣品經(jīng)多功能粉碎機粉碎，豬肌肉和肝臟樣品經(jīng)勻漿后，準確稱取試樣5.00 g(精確至0.01 g)，放入PLE萃取池中，將加壓溶劑萃取儀(PLE)設置為表2的萃取條件后開始萃取，萃取完成后，將萃取液轉移到50 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，上清液用氮氣[(45±5) ℃]吹干。殘渣用乙腈/水(10/90，V/V)3 mL定容，準備ASPE裝置凈化。

表2PLE設備萃取不同樣品中膠霉毒素的條件選擇
Table2SelectedPLEoperatingconditionsfromdifferentsamples

提取條件玉米、小麥及飼料豬肌肉和肝臟溶劑乙腈/水(50/50，V/V)乙腈/正己烷(60/40，V/V)萃取壓力/psi15002000萃取溫度/℃8080靜態(tài)萃取時間/min58沖洗體積/%6060清洗時間/min12循環(huán)次數(shù)11萃取池體積/mL1111

參考文獻[9]中方法，采用全自動固相萃取(ASPE)裝置凈化。取經(jīng)PLE提取的提取液3 mL，置全自動固相萃取(ASPE)裝置中?；罨?、上柱、淋洗和洗脫全部按設定程序自動完成。所用試劑分別為：活化液為甲醇和水各3 mL；淋洗液為甲醇/水(5/95，V/V)5 mL，洗脫液為甲醇/水(85/15，V/V)4 mL。所有程序結束后，收集洗脫液，50 ℃氮氣吹干。

最后，所有樣品均用乙腈/水(10/90，V/V)1 mL定容，過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS測定。

1.3.4 定量測定

所有采集的樣品均采用建立的檢測方法進行空白基質的篩選，測定結果為無任何干擾峰的基質作為空白基質，用于樣品添加試驗。采用基質匹配工作曲線外標法定量。

2 結果與討論

2.1色譜及質譜條件的選擇

色譜條件選擇時，本研究參考文獻[8]研究結果，選用Kinetex 100 RP-18柱，實現(xiàn)了5 min內(nèi)分離膠霉毒素。同時試驗了不同流動相比例和梯度程序，結果發(fā)現(xiàn)，乙腈/0.5%乙酸水溶液(50/50，V/V)作為流動相獲得良好的分離(圖1)，這與文獻[9]報道一致。質譜條件選擇時，LEWIS[3]報道采用ESI源下的負離子掃描模式，而本文發(fā)現(xiàn)雖然膠霉毒素既可離子化為正離子，又可離子化為負離子，但是當膠霉毒素采用負離子掃描時，空白溶劑中與它同一保留時間處會出峰，對檢測存在干擾；而且負離子模式的響應值遠遠低于正離子模式。所以，本文結合膠霉毒素結構特點，最終選擇了ESI源下的正離子掃描模式。在MRM狀態(tài)下，優(yōu)化各項參數(shù)，得到了最優(yōu)的二級全掃描質譜圖(圖1)。

圖1 空白玉米樣品添加2 μg/kg膠霉毒素的特征離子質量色譜圖
Fig.1 LC-ESI-MS/MS chromatograms obtained in positive ion mode of 2 μg/kg gliotoxin

2.2提取條件的選擇

對于真菌毒素，甲醇和乙腈是最常用的提取試劑，文獻在這方面有大量的報道[12-14]，本研究參考CHEN等[7]依次對PLE的提取溶劑、壓力、溫度和時間等參數(shù)分別進行優(yōu)化，同時結合文獻[9]、[10]、[11]對PLE條件的優(yōu)化方法，分別對不同的樣品進行試驗，結果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈和水的混合液提取玉米、小麥及飼料取得較高的回收率分別為89%、92%和95%，同時基質效應也能滿足要求(采用t檢驗的方法來考察基質效應，t值均小于2.4)。而對于動物性食品，脂肪含量較高，所以本文選用不同比例的乙腈和正己烷作為提取試劑，使提取和去除脂肪一步完成。結果顯示，乙腈/正己烷比例為(60/40，V/V)時效果較好(回收率為87%)。此外，實驗結果表明乙腈比甲醇更適合做提取試劑，這與文獻[9]報道一致。同時根據(jù)儀器的適用條件對其他萃取條件分別進行選擇，結果發(fā)現(xiàn)，不同的樣品需要的萃取條件不同，成分復雜的動物性食品需要更高的萃取壓力(2 000 psi)，更長的萃取時間(8 min)才能取得最優(yōu)的效果，具體結果見表2。

2.3固相萃取凈化條件的選擇

經(jīng)過提取后的樣品一般都要進行進一步的凈化才能進入HPLC-MS/MS儀檢測。根據(jù)文獻，真菌毒素的凈化柱種類很多[15-21]，文獻[15]、[16]采用Bond Elut Mycotoxin柱取得很好的效果，文獻[17]比較了Oasis HLB柱，Mycosep 226和228柱，認為Mycosep 226柱回收率最高。而文獻[18]認為Oasis HLB SPE柱(200mg, 6cm)柱在凈化多種毒素時效果最優(yōu)。這與本課題組之前的研究結果一致[8]。本文依次以玉米、豬飼料、豬肝臟為研究對象分別試驗了Mycosep 226柱、Oasis HLB柱和Bond Elut Mycotoxin柱，經(jīng)比較實驗, 所有基質都選用Oasis HLB柱，豬肝臟的試驗結果見圖2。

圖2 豬肝臟添加膠霉毒素采用3種不同固相萃取柱凈化的回收率值
Fig.2 Recovery test of three SPE candidate cartridges in swine liver sample spiked with gliotoxin standard mycotoxins

此外，本方法采用全自動固相萃取技術, 重復性優(yōu)于傳統(tǒng)手動SPE萃取裝置，同時，參考文獻[22]、[23]、[24]對全自動固相萃取裝置各項參數(shù)進行優(yōu)化，結果得出：淋洗液選用甲醇/水(5/95，V/V)5 mL，去雜效果最好，且待測物仍保留。洗脫液選用甲醇/水(85/15，V/V)4 mL時可得到最高的回收率。

2.4基質效應考查

采用t檢驗的方法來考察基質效應。公式如下：

(1)

式中：a1表示標準曲線的斜率；a2表示基質匹配工作曲線的斜率；es(a1-a2) 表示a1和a2斜率的標準差；α置信度為0.05；若t(n-4)值>2.4，說明存在基質效應。

經(jīng)過試驗，膠霉毒素在玉米、小麥、肌肉和肝臟中的t值分別為4.5、3.2、9.1和12.1。所以，本研究采用基質匹配工作曲線進行定量。對于豬和雞的不同基質，t檢驗后無顯著差異，所以雞肝臟和腎臟都采用豬肝臟和腎臟基質匹配工作曲線進行定量。

2.5檢出限、定量限及線性范圍

在方法學驗證中，本研究在文獻[25]的基礎上，利用配制成的空白樣品中按0.2、1.0、2.0、20、50、100 μg/L的水平添加膠霉毒素標準工作液進樣檢測，繪制標準工作曲線。以峰面積Y對進樣質量濃度X進行線性回歸，以3倍信噪比確定樣品的檢出限，以10倍信噪比確定樣品的定量限。膠霉毒素在玉米、小麥、豬和雞的飼料、豬的肌肉和肝臟等樣品中線性回歸方程、相關系數(shù)(R2)、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)見表3。

2.6準確度和精密度

空白樣品按3個水平添加膠霉毒素標準品，每個水平平行測定6次，考察方法的回收率與精密度(表4)，由結果可知膠霉毒素在不同樣品中的平均回收率介于81.8%～95.4%，變異系數(shù)≤13.2%，滿足準確度和精密度的監(jiān)控要求。

3 結論

本研究利用加壓溶劑萃取和全自動固相萃取富集結合高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術，建立了一種可快速、靈敏測定多種食品和飼料中膠霉毒素的方法。通過前處理條件的選擇和液相質譜條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了操作的自動化，膠霉毒素在不同樣品中的最低檢出限在(0.09～0.15) μg/kg，最低定量限在(0.23～0.31) μg/kg。

表3膠霉毒素的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限
Table3Regressionequation,correlationcoefficient,limitofdetectionandlimitofquantizationforgliotoxin

樣品回歸方程相關系數(shù)檢出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)飼料Y=5．23×104X+3．12×1030．99790．150．22玉米Y=3．41×105X+2．92×1040．99910．130．31小麥Y=2．11×105X+1．92×1040．99870．090．23豬肌肉Y=5．82×104X+4．61×1030．99850．110．27豬肝臟Y=3．81×104X+3．53×1030．99580．120．24

表4不同樣品中添加膠霉毒素R及RSD
Table4Therecoveriesandcoefficientsofgliotoxininspikeddifferentmatrixes

樣品膠霉毒素添加量/(μg·kg-1)膠霉毒素回收率/%變異系數(shù)/%0．381．8±11．912．5飼料0．682．9±10．211．51．283．6±11．213．20．392．1±6．35．3玉米0．694．2±10．211．41．290．2±5．45．90．384．3±9．311．8小麥0．691．5±9．211．81．284．4±10．612．00．393．6±5．65．6肌肉0．695．4±7．78．31．292．3±4．55．60．385．8±6．36．6肝臟0．691．1±12．412．91．287．4±10．310．9

最終該方法各項指標都可滿足定量確證要求，可用于食品和飼料中可能存在威脅人類和動物健康的膠霉毒素的痕量監(jiān)測中。