陳玲玲 徐進(jìn)平

摘要 [目的]設(shè)計(jì)和構(gòu)建一種由β-糖苷水解酶Gluc1C和多功能纖維素酶EGX融合而成的纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C。[方法]首先構(gòu)建了嵌合體的質(zhì)粒，采用GST標(biāo)準(zhǔn)純化方法，分別獲得重組蛋白Gluc1C、EGX、纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C，并且制備了抗Gluc1C的血清。[結(jié)果]通過(guò)GST純化的3個(gè)蛋白純度達(dá)90%，可以進(jìn)行后續(xù)的酶活檢測(cè)；通過(guò)Western blot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)抗Gluc1C的血清效價(jià)很高（稀釋比例達(dá)1∶5 000）。[結(jié)論]該研究可為纖維素酶的工業(yè)化應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 纖維素酶；EGX；Gluc1C；抗體；纖維素酶嵌合體

中圖分類號(hào) S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）01-0102-03

Abstract [Objective]To design and construct chimera cellulase EGX-Gluc1C originated from the fusion of β-glucosidase Gluc1C and a cullulase EGX. [Method]First， we generated the plasmid inserting chimera cellulase. Then， we purified the recombinant Gluc1C， EGX and EGX-Gluc1C according to the standard GST purification manual. We also generated the anti-Gluc1C serum from the rabbit. [Result]The coomassie staining results demonstrated that the purity of these proteins was 90%， which was sufficient for enzyme catalytic assay. Through verification of western blot，the anti-Gluc1C serum produced from rabbit was of high quality and the dilution ratio can be 1∶5 000. [Conclusion]The study provided a theoretical basis for the industrial application of cellulase.

Key words Cellulase；EGX；Gluc1C；Antibody；Chimera cellulase

纖維素是陸地環(huán)境中最主要的光合作用產(chǎn)物，也是地球上最豐富的可再生生物資源，每年纖維素的產(chǎn)量為1 000億t左右。纖維素降解無(wú)論是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)還是廢物處理的過(guò)程中，都顯得十分重要，因?yàn)槔w維素處理好就能夠得到大量可再生生物資源，處理不好將成為難以降解的生物垃圾[1-3]。纖維素降解需要多種纖維素酶協(xié)同作用，如果能夠使用一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)同時(shí)表達(dá)純化2種甚至多種纖維素酶，則可以降低工業(yè)生產(chǎn)中酶的經(jīng)濟(jì)投入[4-5]。EGX是從福壽螺中分離得到的一種多功能纖維素酶，Gluc1C是從棉鈴蟲腸道菌中分離得到的一種高效的β-糖苷水解酶，由448個(gè)氨基酸組成，包含糖苷水解酶GH superfamily 1結(jié)構(gòu)域[6]。筆者將EGX和Gluc1C的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒上，并表達(dá)出有生物活性的纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C，以期為纖維素酶的工業(yè)化應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒。

試驗(yàn)所用的菌株包括 E.coli TOP10、 E.coli RIL （DE3），質(zhì)粒pGEX-6p-1、pET22b-Gluc1C和pET32a-EGX。

1.1.2 生化試劑。DNA Taq 酶（康為公司）、KOD Plus Neo聚合酶（TOYOBO）、限制性內(nèi)切酶（TOYOBO）、T4 DNA連接酶（Thermo Scientific）、膠回收試劑盒（康為公司）、PCR回收試劑盒（康為公司）、Tiangen質(zhì)粒小提試劑盒、GST resin（Q-Smart公司）。

1.1.3 引物及核苷酸序列。

試驗(yàn)采用的引物用DNAman軟件設(shè)計(jì)，引物合成由武漢天一輝遠(yuǎn)公司完成，引物名稱及序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建。以實(shí)驗(yàn)室已有的pET22b-Gluc1C和pET32a-EGXA作為模板構(gòu)建EGX-Gluc1C嵌合體。

1.2.2 重組工程菌的制備。

將質(zhì)粒pGEX-6p-1-EGX-Gluc1C轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，得到的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落即為能表達(dá)嵌合體纖維素酶EGX-Gluc1C的大腸桿菌重組基因工程菌RIL pGEX-6p-1-EGX-Gluc1C。

1.2.3 重組蛋白的純化。按照標(biāo)準(zhǔn)GST樹脂結(jié)合標(biāo)簽蛋白的方法純化目的蛋白。蛋白的表達(dá)和純化通過(guò)SDS-PAGE以及考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。

1.2.4 Gluc1C抗體的制備。

將純化的纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C包涵體經(jīng)過(guò)SDS-PAGE后，切割包含目的條帶的膠條，作為抗原，輔以佐劑Freunds Adjuvant Incomplete注射進(jìn)入新西蘭大白兔體內(nèi)，總蛋白量為2 mg，每隔14 d免疫1次，共3次，制備抗Gluc1C的免疫血清。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-EGX-Gluc1C的構(gòu)建 以實(shí)驗(yàn)室已有的pET32a-EGXA作為模板，用引物4和5擴(kuò)增EGX序列，然后再以這一步得到的PCR產(chǎn)物作為模板，用引物4和6擴(kuò)增包含linker序列的EGX序列。使用酶切位點(diǎn) Eco R I和 Bam H I將目的序列插入到pGEX-6P-1載體上（圖1）。接著以實(shí)驗(yàn)室已有的pET22b-Gluc1C作為模板，用引物1和2擴(kuò)增EGX序列，回收以后，使用酶切位點(diǎn) Xho I

和 Eco R I將目的序列插入到pGEX-6P-1-EGX（含linker）載體上。圖2為嵌合體載體雙酶切鑒定結(jié)果。接著，將測(cè)序正確的3個(gè)質(zhì)粒pGEX-6P-1-EGX、pGEX-6P-1-Gluc1C、pGEX-6P-1-EGX-Gluc1C轉(zhuǎn)入 E.coli RIL（DE3），獲得能夠表達(dá)3個(gè)相應(yīng)蛋白的工程菌。

2.2 融合蛋白的表達(dá)與純化

表達(dá)目的蛋白的重組工程菌株RIL pGEX-6P-1-EGX的表達(dá)條件為IPTG 0.4 mmol/L，28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3 h，培養(yǎng)體積為1 L。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的GST純化流程進(jìn)行蛋白純化。從洗脫組分看，第1次洗脫的蛋白濃度最高，依次減少，獲得的蛋白較純，僅在40 kD上方有一處雜帶。通過(guò)同樣的純化方法，獲得了重組蛋白EGX，EGX-Gluc1C，并且濃縮洗脫組分，最終蛋白濃度統(tǒng)一為0.5 mg/mL（圖3）。

2.3 抗Gluc1C抗體的制備及效價(jià)檢測(cè)

為了能夠更深入地研究Gluc1C的功能，制備了抗Gluc1C的血清。選擇直接用目的蛋白的包涵體作為抗原，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE后，切割包含目的條帶的膠條，注射進(jìn)入兔子體內(nèi)。每隔7 d免疫1次，共3次，最終獲得抗Gluc1C的免疫血清，通過(guò)Western blot檢測(cè)了血清的效價(jià)。取Gluc1C和嵌合體的誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后蛋白樣進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，獲得的免疫血清能夠很好地識(shí)別目的蛋白Gluc1C，并且也能識(shí)別嵌合體（圖4）。

3 討論與結(jié)論

纖維素是地球上現(xiàn)存分布最廣和含量最豐富的碳水化合物[7]。對(duì)人類而言，纖維素也是自然界中數(shù)量最大的可再生資源，它的降解和再利用無(wú)疑是自然界碳素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。纖維素酶作用于纖維素的分子機(jī)制至今沒(méi)有完全研究清楚，纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶能力不足，以及所產(chǎn)生的纖維素酶的組分不全是導(dǎo)致這一領(lǐng)域的研究與實(shí)際應(yīng)用存在一定距離的主要原因[8]。不同的微生物合成的纖維素酶不僅在組成上有顯著的差異，而且對(duì)纖維素的水解能力也大不相同，原核生物和真核生物均能產(chǎn)纖維素酶[9-10]。該研究構(gòu)建了纖維素酶嵌合體EGX-Gluc1C ，其中EGX是從福壽螺胃液中分離得到的一種多功能纖維素酶，同時(shí)具有多種纖維素酶活性，Gluc1C是從類芽孢桿菌中分離出的一種β-糖苷水解酶。中間以甘氨酸和絲氨酸構(gòu)成的柔性肽重復(fù)序列（G4S）3連接，保證了2個(gè)蛋白之間的空間結(jié)構(gòu)不受影響。共獲得了純度較高的3種蛋白，濃縮以后，3種蛋白的濃度統(tǒng)一確定為0.5 mg/mL。同時(shí)還獲得了效價(jià)很高的抗Gluc1C的兔血清，為將來(lái)嵌合體的活性研究提供了基礎(chǔ)。未來(lái)的研究還會(huì)涉及到嵌合體在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)是否會(huì)增強(qiáng)其活力；嵌合體在pH耐受、熱穩(wěn)定性方面是否有提高。

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