魏罡　張欣　張智　王婧　劉洋　楊可心　呂歌　武天琪　高群

摘要[目的]優(yōu)化超聲波輔助酶法提取油茶籽殼色素的最佳工藝。[方法]以油茶籽殼為原材料，采用超聲波輔助酶法提取油茶籽殼色素，以響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其提取條件。[結(jié)果]最佳提取條件：加酶量為0.8%，液固比20：1（g：mL），超聲提取時(shí)間15min，超聲提取功率90w，超聲提取溫度60℃。在此條件下測(cè)得的吸光度為2.765。酶輔助超聲波法提取油茶籽殼色素較酶法和超聲波提取法油茶籽殼色素吸光度提高了1.8、1.5倍。[結(jié)論]該研究?jī)?yōu)化了超聲波輔助酶法提取油茶籽殼色素最佳工藝條件，為油茶籽殼色素的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 油茶籽殼色素；超聲波輔助酶法；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-661I（2018）11-0004-06

油茶（CamelliaoleiferaAbel）為山茶科山茶屬多年生木本油料作物，是我國(guó)最重要的食用油料樹種之一，與油橄欖、油棕和椰子并稱為世界四大木本食用油料樹種。我國(guó)是世界上油茶品種最多、茶油籽產(chǎn)量最高的國(guó)家。油茶樹的種子由油茶籽殼和籽仁組成，為多年生多次收獲。油茶栽培在我國(guó)已有2000多年的歷史，目前主要分布在湖南、江西、廣西、福建、安徽、貴州、云南等?。▍^(qū)），在四川、陜西、江蘇和臺(tái)灣也有少量栽培。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)現(xiàn)有油茶栽培面積約300萬(wàn)hm²，年產(chǎn)油茶籽量約100萬(wàn)t，年產(chǎn)茶油約26萬(wàn)t，年產(chǎn)茶粕約68萬(wàn)t，總產(chǎn)值約110億元。

油茶果榨油后廢棄的籽粕提取的油茶籽殼色素，是具有巧克力樣色澤的棕色素。目前，我國(guó)食用棕色素絕大部分從國(guó)外進(jìn)口，且價(jià)格較高，而國(guó)內(nèi)對(duì)于油茶籽殼的研究主要表現(xiàn)在制備糠醛、木糖醇和活性炭等方面，在油茶籽殼色素方面的研究較少。1993年劉曉庚分析了油茶副產(chǎn)物的成分及應(yīng)用；1985年凌誠(chéng)德開展了國(guó)產(chǎn)食用天然色素油茶果殼棕色素毒性試驗(yàn)，指出油茶果殼棕色素是安全性較高的可食用天然色素，但尚未見對(duì)該色素的提取及其他功能活性研究的報(bào)道。

采用酶提取法和超聲波提取法從植物中提取天然色素的研究國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道，也有采用超聲波輔助酶法從榛子殼、白玉蘭、大棗皮、山楂皮等材料中提取天然植物色素，但以此方法提取油茶籽殼色素的研究鮮見報(bào)道。酶解反應(yīng)具有高效性、專一性的特點(diǎn)，針對(duì)植物細(xì)胞壁的構(gòu)成，選擇相適應(yīng)的酶溶解細(xì)胞壁，能夠顯著提高植物中有效成分的萃?。怀暡ㄝ腿〖夹g(shù)是通過快速的機(jī)械振動(dòng)波引起的一系列物理和化學(xué)效應(yīng)加速色素物質(zhì)的溶出，有利于提高油茶籽殼色素得率。筆者以油茶籽殼為原材料，采用超聲波協(xié)同酶法提取油茶籽殼色素，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化得到最佳提取條件，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，旨在為油茶籽殼色素的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料 油茶，重慶秀山縣；纖維素酶（8000U/g），山東長(zhǎng)泰生物科技有限公司；其他化學(xué)藥品均購(gòu)置于試劑公司。

1.2儀器 765MC紫外可見分光光度計(jì)，上海精密儀器廠；KQ3200DE型超聲波數(shù)控清洗儀，昆山市超聲儀器廠；pH計(jì)，奧立龍ThennoOrion，美國(guó)；ALC-110電子天平，上海天平儀器廠；DFT-100多功能粉碎機(jī)，大德機(jī)械總廠；DFC-6053型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；DK-98-IIA恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1油茶籽殼色素提取工藝流程。油茶籽殼→干燥→粉碎→稱取1g油茶籽殼粉一加入提取溶劑20mL→酶解→超聲波提取→抽濾→油茶籽殼色素粗提液→定容→稀釋→測(cè)定吸光度。

1.3.2油茶籽殼色素最大吸收峰測(cè)定。稱取1g油茶籽殼粉末加入20mL一定濃度的乙醇溶液，超聲功率100w（溫度50℃）提取10min，取上清液。稀釋10倍后，在250～600nm處掃描，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.3酶法提取油茶籽殼色素單因素試驗(yàn)。取1g油茶籽殼粉，加入提取溶劑，在其他提取條件一致的情況下，根據(jù)油茶籽殼色素在最大吸收峰處的吸光度，間接得到油茶籽殼色素的得率。分別考察緩沖溶液的pH（4.6、5.8、6.4、7.2、8.0）、酶解溫度（30、40、50、60、70℃）、液固比[10：1、20：1、30：1、40：1、50：1（g：mL），下同]、加酶量（0.2%、0.8%、1.4%、2.0%、6.0%）、酶解時(shí)間（30、60、90、120、360min）5個(gè)單因素對(duì)油茶籽殼色素提取效果的影響。

1.3.4超聲波輔助酶法提取油茶籽殼色素單因素試驗(yàn)。

1.3.4.1提取溶劑篩選。分別稱取油茶籽殼粉末6份，每份1.0g，置于6支三角瓶中，分別加入20mL蒸餾水、石油醚、甲醇、丙酮、40%乙醇、60%乙醇；于60次/min往復(fù)振蕩水浴鍋提取24h后，測(cè)浸提液顏色，以顏色深者確定為提取溶劑。

1.3.4.2提取超聲功率單因素試驗(yàn)。取1g油茶籽殼粉，在酶解提取因素最優(yōu)的條件下，考察不同超聲功率（70、80、90、100、120w）、不同超聲溫度（30、40、50、60、70℃）、不同超聲時(shí)間（5、10、15、20、25min）3個(gè)單因素對(duì)油茶籽殼色素提取效果的影響。

1.3.5超聲波輔助酶法提取色素響應(yīng)面試驗(yàn)。依據(jù)Box—Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以超聲功率、超聲溫度、加酶量、液固比4個(gè)指標(biāo)為考察對(duì)象，采用DesignExpert8.05響應(yīng)面軟件設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，優(yōu)化油茶籽殼色素提取最優(yōu)條件。響應(yīng)面分析因素和水平見表1。

1.3.6不同方法提取油茶籽殼色素比較。在最優(yōu)提取條件下，分別采用酶法、超聲波法、酶輔助超聲提取法提取油茶籽殼色素，在最大吸收峰處測(cè)定其吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1油茶籽殼色素最大吸收峰的確定從圖1可以看出，在波長(zhǎng)250～600nm對(duì)油茶籽殼色素進(jìn)行掃描，在波長(zhǎng)267nm處吸光度最大，為最大吸收波長(zhǎng)。因此，后續(xù)試驗(yàn)油茶籽殼色素吸光度的測(cè)定均在267nm波長(zhǎng)下進(jìn)行。

2.2酶法提取油茶籽殼色素的單因素試驗(yàn)

2.2.1pH對(duì)提取效果的影響。由圖2可知，油茶籽殼色素在pH為4.6～5.8時(shí)，吸光度呈直線增加；在pH5.8時(shí)油茶籽殼色素的吸光度最大，為1.01；當(dāng)pH繼續(xù)增加時(shí)油茶籽殼色素的吸光度開始下降。這是因?yàn)樵趐H5.8時(shí)，酶能夠發(fā)揮最大活力，超過最適范圍后，細(xì)胞內(nèi)化學(xué)環(huán)境不利于酶解作用，使酶活性降低。

2.2.2溫度對(duì)提取效果的影響。由圖3可知，溫度在30～60℃時(shí)，酶解溫度升高，油茶籽殼色素的吸光度也隨之增加；60℃時(shí)油茶籽殼色素吸光度為1.23，達(dá)到最大；超過60℃后吸光度稍有降低。這是因?yàn)樵诿附夥磻?yīng)的適宜溫度內(nèi)，溫度升高能夠加快酶解速度，使色素快速溶出；超過最適酶解溫度，酶活力降低。綜合考慮，選擇最佳提取溫度為50℃。

2.2.3液固比對(duì)提取效果的影響。由圖4可知，液固比在20：1之前，色素吸光度呈線性增加；20：1時(shí)油茶籽殼色素的吸光度達(dá)到峰值，為1.32；超過20：1時(shí)，油茶籽殼色素的吸光度降低，這是因?yàn)楫?dāng)超過最佳比值時(shí)，溶液增加酶的濃度降低，達(dá)不到最佳酶解效果。因此確定20：1為較適宜的酶解液固比。

2.2.4加酶量對(duì)提取效果的影響。由圖5可知，加酶量為0.8%時(shí)，油茶籽殼色素的吸光度最大；當(dāng)酶用量超過0.8%時(shí)，油茶籽殼色素的吸光度略有下降。這是因?yàn)槊赣昧吭谝欢ǚ秶鷷r(shí)，酶解速率與加酶量呈正相關(guān)，超過這一范圍，油茶籽殼色素吸光度不再增加反而降低。因此，確定0.8%為較適宜的酶用量。

2.2.5酶解時(shí)間對(duì)提取效果的影響。由圖6可知，酶解時(shí)間在30～120min，油茶籽殼色素的吸光度隨酶解時(shí)間的增加而升高；酶解時(shí)間為120min時(shí)，油茶籽殼色素的吸光度達(dá)到最大，為1.06；超過此時(shí)間，油茶籽殼色素吸光度降低。因此，選擇120min為較適宜的酶解時(shí)間。

2.3超聲波輔助酶法提取油茶籽殼色素條件優(yōu)化

2.3.1提取溶劑。不同提取溶劑對(duì)油茶籽殼色素的提取效果明顯不同。通過浸提液顏色可以看出，油茶籽殼色素可溶于極性較大的溶劑中，不溶或難溶于非極性溶劑中，其中乙醇具有較強(qiáng)提取能力，提取液為深棕色或棕色，丙酮和甲醇有一定提取能力，提取液為淺黃色，非極性或極性較小的試劑如石油醚不能提取色素。通過浸提液顏色判斷，60%乙醇提取的油茶籽殼溶液顏色最深，提取效果最好。

2.3.2提取功率。由圖7可知，當(dāng)提取功率為90w時(shí)，油茶籽殼色素的吸光度達(dá)到最大；超聲功率超過90w時(shí)，油茶籽殼色素的吸光度隨著功率的增加而降低。這里因?yàn)樵诔暪β瘦^小時(shí)，組織破碎不完全導(dǎo)致色素未完全釋放，功率太大會(huì)導(dǎo)致油茶籽殼色素因熱量堆積而分解，致使結(jié)構(gòu)破壞，從而使色素吸光度降低，不利于油茶籽殼色素的提取。綜合考慮，選擇最佳提取功率為90w。

2.3.3提取溫度。由圖8可知，溫度在60℃之前，隨著超聲溫度的升高油茶籽殼色素的吸光度迅速增加，其后隨著超聲溫度的升高，吸光度下降。因此，較適宜的油茶籽殼色素超聲提取溫度為60℃。

2.3.4超聲時(shí)間。由圖9可知，超聲時(shí)間在10min之前，油茶籽殼色素的吸光度直線增加，超聲時(shí)間超過10min后，油茶籽殼色素吸光度下降。超聲時(shí)間過短，色素未完全溶出；超聲時(shí)間太長(zhǎng)，色素由于長(zhǎng)時(shí)間超聲加熱而分解，不利于油茶籽殼色素的提取，導(dǎo)致色素吸光度降低。因此，10min為色素超聲提取的最佳時(shí)間。

2.4超聲波輔助乙醇提取色素響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果及回歸模型方差分析。綜合單因素試驗(yàn)，以加酶量（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）、液固比（D）為考察對(duì)象，采用SPSS19.0軟件優(yōu)化提取工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。以油茶籽殼色素吸光度為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：吸光度=2.57+0.048A+0.032B-0.035C+0.050D-0.056AB-0.091AC-0.200AD+0.065BC+0.088BD+0.056CD-0.540A²-0.740B²-0.680C²-0.590D²。當(dāng)P<0.05時(shí)代表參數(shù)具有顯著影響，P<0.01時(shí)表示參數(shù)具有高度顯著影響，在P<0.001表示參數(shù)具有極顯著影響。該模型P<0.001表示極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著（P>0.1），說(shuō)明該模型構(gòu)建成功，可以用此模型和方程來(lái)推測(cè)油茶籽殼色素的得率。

方差分析結(jié)果表明，模型中交互項(xiàng)（AD）、（BC）為差異顯著影響因素（P<0.05）。二次項(xiàng)各因素中A²、B²、C²、D²為差異極顯著影響因素（P<0.001）。失擬項(xiàng)（P=0.19）較小，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合程度好，誤差小，因此該模型成立。各因素對(duì)油茶籽殼色素吸光度影響由大到小依次為液固比（D）、加酶量（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）。

2.4.2響應(yīng)面分析及提取工藝優(yōu)化。圖10～14可知，隨著加酶量、超聲溫度、超聲功率、液固比的增加，油茶籽殼色素吸光度均先增加達(dá)到峰值后下降，其中AD的交互作用最明顯，BC的交互作用其次。

油茶籽殼色素的最佳提取條件：加酶量為0.8%，液固比20：1，超聲提取時(shí)間15min，超聲提取功率90W，超聲提取溫度60℃。油茶籽殼色素吸光度理論值為2.672。根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)考察試驗(yàn)結(jié)果是否可行，重復(fù)5次后，驗(yàn)證油茶籽殼色素吸光度值平均值為2.765，與理論值的相對(duì)誤差為3.4%，說(shuō)明驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程預(yù)測(cè)值高度吻合，此提取工藝條件可靠性較高。

2.5不同方法提取油茶籽殼色素比較由圖15可知，在最優(yōu)條件下，纖維素酶法提取油茶籽殼色素吸光度為1.538，超聲波提取油茶籽殼色素的吸光度為1.789，超聲波輔助酶法提取油茶籽殼色素吸光度為2.765。由此可知，超聲輔助酶法在最優(yōu)條件下油茶籽殼色素提取效果優(yōu)于酶法和超聲波提取法。

3結(jié)論

（1）超聲波輔助酶法提取方法可以顯著提高油茶籽殼色素吸光度，在此最優(yōu)條件下油茶籽殼色素吸光度為2.765，分別是單獨(dú)酶法提取、超聲波提取的1.8、1.5倍。

（2）超聲波輔助酶法提取油茶籽殼色素最佳條件：加酶量為0.8%，液固比20：1，超聲提取時(shí)間15min，超聲提取功率90w，超聲提取溫度60℃。在此條件下測(cè)得的油茶籽殼色素的吸光度為2.765，與理論值的相對(duì)誤差為3.4%。

科技論文寫作規(guī)范——縮略語(yǔ)

采用國(guó)際上慣用的縮略語(yǔ)。如名詞術(shù)語(yǔ)DNA（脫氧核糖核酸）、RNA（核糖核酸）、ATP（三磷酸腺苷）、ABA（脫落酸）、ADP（二磷酸腺苷）、CK（對(duì)照）、CV（變異系數(shù)）、CMS（細(xì)胞質(zhì)雄性不育性）、IAA（吲哚乙酸）、LD（致死劑量）、NAR（凈同化率）、PMC（花粉母細(xì)胞）、LAI（葉面積指數(shù)）、LSD（最小顯著差）、RGR（相對(duì)生長(zhǎng)率），單位名縮略語(yǔ)IRRI（國(guó)際水稻研究所）、FAO（聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織）等。對(duì)于文中有些需要臨時(shí)寫成縮寫的詞（如表及圖中由于篇幅關(guān)系以及文中經(jīng)常出現(xiàn)的詞而寫起來(lái)又很長(zhǎng)時(shí)），則可取各主要詞首字母寫成縮寫，但需在第一次出現(xiàn)處寫出全稱，表及圖中則用注解形式在下方注明，以便讀者理解。