陳亮 陳明霞 李和陽

摘要[目的]對分離自市售高溫滅菌牛奶的產(chǎn)脂肪酶菌株SJXYZ進行鑒定。[方法]通過16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析、形態(tài)觀察和生理生化特性分析，對菌株SJXYZ生物學特性進行初步鑒定。[結果]16S rRNA基因序列分析顯示該菌株屬于芽胞桿菌屬（Bacillus），與B.altitudinis 41KF2bT（高地芽胞桿菌）、B.xiamenensis HYC-10T（廈門芽胞桿菌）、B.safensis FO-36bT（沙福芽胞桿菌）、B.zhangzhouensis DW5-4T（漳州芽胞桿菌）、B.australimaris NH7I_1T（南海芽胞桿菌）和B.pumilus ATCC 7061T（短小芽胞桿菌）相似度皆為97%以上。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，該菌株與B.altitudinis 41KF2bT親緣關系最近，但形成獨立的進化分支，無法歸入已知物種。菌株SJXYZ為革蘭氏陽性，直桿狀，運動性，最適溫度為30～35 ℃，適宜pH為5～9，適宜鹽度（NaCl）為0%～5%;產(chǎn)脂肪酶，不產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶;對氨芐西林（10 μg）、慶大霉素（10 μg）、氟哌酸（10 μg）、頭孢唑啉（30 μg）、四環(huán)素（30 μg）、頭孢噻吩（30 μg）、鏈霉素（10 μg）敏感。所測特性與B.altitudinis 41KF2bT有較大的差異。[結論]菌株SJXYZ可能為新的物種，暫命名為Bacillus sp.SJXYZ。

關鍵詞芽胞桿菌;菌種鑒定;脂肪酶

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）08-0108-02

Identification of a Lipaseproducing Bacillus sp. SJXYZ

CHEN Liang1， CHEN Mingxia1， LI Heyang2

（1.College of Chemical Engineering， Huaqiao University， Xiamen，F(xiàn)ujian 361021;2.Third Institute of Oceanography， State Oceanic Administration， Xiamen， Fujian 361005）

Abstract[Objective] To identify strain SJXYZ， which was isolated from commercial sterilized milk. [Method] Strain SJXYZ was characterized by morphological， biochemical and physiological tests， 16S rRNA gene sequence determination and phylogenetic analyses. [Result]16S rRNA gene analysis indicated that strain SJXYZ belonged to the genus Bacillus and had small higher than 97% similarity to B.altitudinis 41KF2bT， B. xiamenensis HYC10T， B. safensis FO36bT， B. zhangzhouensis DW54T， B. australimaris NH7I_1T and B. pumilus ATCC 7061T. The phylogenetic analysis showed that strain SJXYZ was closest to B. altitudinis 41KF2bT， but formed an independent branch separated from all the reference strains. Cells were gramstainpositive， straight rod， motile. Growth occurred at pH 5-9， at 0%-5% NaCl， and with optimum temperature at 30-35 ℃. Lipase was passive. Proteinase， cellulase and amylase were negative. Sensitive to ampicillin （10 μg）， gentamycin（10 μg）， norxacin （10 μg）， cefazolin （30 μg）， tetracycline （30 μg）， cephalothin （30 μg） and streptomycin （10 μg）. Genomic and phenotypic data of strain SJXYZ shew a big difference from B. altitudinis 41KF2bT. [Conclusion] On the basis of these findings， we propose that strain SJXYZ represents a new species of Bacillus for which we propose the name Bacillus sp. SJXYZ.

Key wordsBacillus;Identification;Lipase

基金項目國家自然科學基金項目（41506179）;福建省自然科學基金項目（2015J01613）;“全球變化與海氣相互作用”專項（GASI-03-01-03-01，GASI-03-01-03-02）;華僑大學高層次人才科研啟動項目（12BS206）。

作者簡介陳亮（1987—），男，湖北漢川人，從事微生物鑒定研究。 *通訊作者，講師，博士，從事海洋微生物資源研究。

收稿日期2018-01-10

芽胞桿菌（Bacillus）是一類革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽胞，需氧或兼性厭氧，大多數(shù)有動力，無莢膜，廣泛存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等各類生境中[1-5]，在生產(chǎn)、生活及環(huán)境生態(tài)中扮演著重要角色。該屬種類繁多，目前有效命名的種類有357種（https：//www.dsmz.de/bacterialdiversity/prokaryoticnomenclatureuptodate/prokaryoticnomenclatureuptodate.html），有的具有致病性，比如可引起人及動物致病的B.anthraci（炭疽芽胞桿菌）和引起食物中毒的B.cereus（蠟狀芽胞桿菌）;有的可作為益生菌，比如B.coagulans（凝結芽胞桿菌）、B.lentus（緩慢芽胞桿菌）、B.subtilis（枯草芽胞桿菌）、B.pumilus（短小芽胞桿菌）和B.licheniformis（地衣芽胞桿菌），這些益生菌在動物腸道中生長繁殖的同時會產(chǎn)生一些活性物質（如枯草菌素、有機酸等），能抑制和殺死腸道病原菌，促進營養(yǎng)物質的消化、吸收，抑制腸源性毒素的產(chǎn)生和吸收，從而調節(jié)和維持動物消化道微生物區(qū)系的平衡;有的可作為微生物農(nóng)藥，比如B.thuringiensis（蘇云金芽胞桿菌）可用于防治直翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目的多種害蟲[6];多數(shù)芽胞桿菌屬細菌可以產(chǎn)生種類繁多的工業(yè)用酶，比如工業(yè)用的高溫淀粉酶主要是由B.licheniformis生產(chǎn)的、B.alkalophilic（嗜堿芽胞桿菌）是堿性纖維素酶的主要生產(chǎn)菌株、B.subtilis（枯草芽胞桿菌）是蛋白酶的主要生產(chǎn)菌株[7]。筆者從市售高壓滅菌的純牛奶中分離一株未知菌株SJXYZ，其菌落呈樹枝狀且產(chǎn)生脂肪酶，該研究對此進行初步鑒定。

1材料與方法

1.1菌株培養(yǎng)

菌株SJXYZ分離自市售高壓滅菌的純牛奶，其培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，25～30 ℃培養(yǎng)。

1.2菌株鑒定

1.2.1菌株16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育學分析。

細菌總DNA采用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518225，上海生工）進行提取，16S rRNA基因片段的擴增方法參考文獻[8]。菌株16S rRNA基因序列由南京金斯特生物技術有限公司測定，所得序列校正后在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對分析并獲取相近菌種的16S rRNA基因序列。利用DNAman（version 5.1，Lynnon BioSoft）軟件進行序列同源性分析及構建16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹。

1.2.2形態(tài)及生理生化特性鑒定。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]的方法，進行培養(yǎng)和部分生理生化特征的測定。

2結果與分析

2.1菌株SJXYZ 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

測序得到16S rRNA基因序列長度為1 133 bp，已提交GeneBank數(shù)據(jù)庫，序列號為HM371427。通過EzBioCloud數(shù)據(jù)庫比對分析表明：菌株SJXYZ與B.altitudinis 41KF2bT、B.xiamenensis HYC-10T、B.safensis FO-36bT、 B.zhangzhouensis DW5-4T、B.australimaris NH7I_1T和B.pumilus ATCC 7061T相似度皆為97%以上。在此基礎上，在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫尋找Bacillus屬的相關序列，并構建相應的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出菌株SJXYZ與B.altitudinis 41KF2bT的親緣關系最近，但處在一個完全獨立的進化分支上。在該進化樹上可以明顯發(fā)現(xiàn)菌株SJXYZ的近源種之間的進化距離較小，菌株SJXYZ與所有近源種之間的距離大于種間距離，無法歸為任何一個已知物種。根據(jù)Drancourt 等[10-11]提出16S rRNA基因序列同源性鑒定規(guī)則，初步將菌株SJXYZ歸為Bacillus屬，命名為Bacillus sp.SJXYZ。

2.2菌株SJXYZ菌落及個體形態(tài)

菌株SJXYZ在LB平板上于30 ℃培養(yǎng)48 h后，菌落為白色，菌落呈擴散性生長，邊緣呈現(xiàn)樹枝狀或羽毛狀，菌落初始光滑、濕潤，后期則干燥或形成皺褶，不透明，無金屬光澤，易挑取。

菌體為革蘭氏陽性，產(chǎn)芽胞，無莢膜，具有運動性，直桿狀，大小約1.1 μm×4.2 μm。

2.3菌株SJXYZ生理生化特性

菌株SJXYZ適宜鹽度（NaCl）為0%～5%，在10%的NaCl下基本不生長;適宜pH為5～9，在pH 4和10下菌株基本不生長;最適溫度為30～35 ℃。氧化酶、過氧化氫酶及脂肪酶陽性，淀粉酶、蛋白酶及纖維素酶陰性。對氨芐西林（10 μg）、慶大霉素（10 μg）、氟哌酸（10 μg）、頭孢唑啉（30 μg）、四環(huán)素（30 μg）、頭孢噻吩（30 μg）、鏈霉素（10 μg）敏感。

3討論

16S rRNA基因序列同源性分析在細菌的分類鑒定中具有非常重要的作用，一般將同源性高于95%的細菌歸為同一個屬，同源性高于97%或98%的細菌歸為同一個種[10-11]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬細菌的16S rRNA基因序列同

源性普遍偏高，相近種之間很難通過16S rRNA基因序列的

同源性進行區(qū)分[12-13]。Liu等[13]對1 007個芽胞桿菌屬菌株的16S rRNA基因序列進行種間、種內及菌株間3個水平統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)該屬細菌種內及菌株內的16S rRNA同源性為99.14%～100%，而種間同源性為97.34%～100%，相近種之間極其容易混淆。菌株SJXYZ與最近種B.altitudinis 41KF2bT的16S rRNA基因序列同源性為97.96%，兩者的生理生化特性也有較大差異：B.altitudinis 41KF2bT[2]蛋白酶、淀粉酶陽性，脂肪酶陰性，在pH 5 條件下不生長，對氨芐西林、氟哌酸、頭孢唑啉有抗性，而菌株SJXYZ剛好相反。綜上可見，菌株Bacillus sp.SJXYZ極有可能是芽胞桿菌屬內的一個全新的物種，后續(xù)需要通過更加全面的系統(tǒng)鑒定以確定其分類地位，包括DNA-DNA同源性、G+C含量（mol%）、ANI（平均核苷酸同源性）、脂肪酸組分分析和醌組分分析等一系

列生理生化及分子方面指標的測定。此外，菌株SJXYZ分離

自高溫滅菌的市售牛奶，其存在可能與牛奶的保質期直接相關，也警示著牛奶加工產(chǎn)業(yè)滅菌工藝有待完善。

參考文獻

[1] LIU Y，LAI Q，DU J L，et al.Bacillus zhangzhouensis sp.nov and Bacillus australimaris sp.nov[J].International journal of systematic & evolutionary microbiology，2016，66（3）：1193-1199.

[2] SHIVAJI S，CHATURVEDI P，SURESH K，et al.Bacillus aerius sp.nov.，Bacillus aerophilus sp.nov.，Bacillus stratosphericus sp.nov.and Bacillus altitudinis sp.nov.，isolated from cryogenic tubes used for collecting air samples from high altitudes[J].International journal of systematic & evolutionary microbiology，2006，56（Pt 7）：1465-1473.

[3] LEE J B，JEON S H，CHOI S G，er al.Bacillus piscis sp.nov.，a novel bacterium isolated from the muscle of the antarctic fish Dissostichus mawsoni[J].Journal of microbiology，2016，54（12）：809-813.

[4] NIU L J，XIONG M J，ZHANG J，et al.Bacillus camelliae sp.nov.，isolated from Puer tea [J/OL].International journal of systematic & evolutionary microbiology，2018[2017-12-18].https：//doi.org/10.1099/ijsem.0.002542.

[5] SECH E H，BEYE M，TRAORE S I，et al.Bacillus kwashiorkori sp.nov.，a new bacterial species isolated from a malnourished child using culturomics [J/OL].Microbiology open，2017[2017-12-18].https：//doi.org/10.1002/mbo3.535.

[6] NAVON A.Bacillus thuringiensis，application in agriculture.Entomopathogenic Bacteria：From Laboratory to Field Application[M].Netherlands：Springer，2000.

[7] 劉國紅，林乃銓，林營志，等.芽孢桿菌分類與應用研究進展[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2008，23（1）：92-99.

[8] DELONG E F.Archaea in coastal marine environments [J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，1992，89（12）：5685-5689.

[9] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[10] DRANCOURT M，BOLLET C，CARLIOZ A，et al.16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates [J].Journal of clinical microbiology，2000，38（10）：3623-3630.

[11] DRANCOURT M，BERGER P，RAOULT D.Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans [J].Journal of clinical microbiology，2004，42（5）：2197-2202.

[12] LIU Y，LAI Q L，DU J，et al.Reclassification of Bacillus invictae as a later heterotypic synonym of Bacillus altitudinis[J].International journal of systematic & evolutionary microbiology，2015，65（8）：2769-2773.

[13] LIU Y，LAI Q L，GKER M，et al.Genomic insights into the taxonomic status of the Bacillus cereus group [J].Scientific reports，2015，5：14082.