李楊

摘要 [目的]篩選出適合于cDNA文庫構(gòu)建的豬苓菌核及菌絲體總RNA的提取方法。[方法]采用Trizol改良法和EASY Spin植物快速提取試劑盒法（簡稱試劑盒法）對豬苓菌絲及菌核的總RNA進行提取。[結(jié)果]經(jīng)紫外分光光度計對所得總RNA的均一性及1%瓊脂糖凝膠電泳對所得總RNA的完整性檢測后發(fā)現(xiàn)，2種方法均可提出完整的總RNA，試劑盒法相較于Trizol改良法其所提取的總RNA質(zhì)量和純度都較好，但Trizol改良法所提取的總RNA產(chǎn)率比較高。[結(jié)論]LD-PCR成功合成了豬苓菌核和菌絲體的cDNA產(chǎn)物，呈彌散狀分布在1 000～5 000 bp和750～2 500 bp，滿足cDNA建庫的要求。

關(guān)鍵詞 豬苓；菌絲；菌核；總RNA提取方法

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）02-0063-03

Abstract [Objective]To screen out the method for extracting total RNA from Polyporus umbellatus mycelium and sclerotium suitable for cDNA library construction. [Method]The total RNA of mycelium and sclerotium of P. umbellatus was extracted by improved Trizol method and EASY Spin plant RNA kit method（kit method for short）. [Result]The total RNA was homogenized by UV spectrophotometer and the integrity of the obtained total RNA was detected by 1% agarose gel electrophoresis. It was found that both methods could provide the complete total RNA. Compared with the kit method， the total RNA extracted by the improved Trizol method was better in quality and purity， but the total RNA extracted by improved Trizol method had higher yield. The cDNA of mycelium and sclerotium of P. umbellatus was successfully synthesized by LDPCR and distributed in the range of 1 000-5 000 bp and 750-2 500 bp， which satisfied the requirement of cDNA library construction.

Key words Polyporus umbellatus；Mycelium；Sclerotium；Total RNA extraction method

cDNA文庫構(gòu)建是現(xiàn)代生物技術(shù)研究中一項很重要的技術(shù)，是大規(guī)模與高效率獲得基因序列的有效途徑，特別是對基因組龐大且短期內(nèi)不能進行全基因組測序的某些物種來說，其是有效開展功能基因組研究的一條重要途徑[1]。通過構(gòu)建全長cDNA文庫能夠直接發(fā)現(xiàn)并克隆與生命活動有關(guān)的調(diào)控基因，進而闡述其基因所編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)及其相互作用的關(guān)系。然而，構(gòu)建高質(zhì)量的全長cDNA文庫并不容易，要獲得完整的mRNA就是一個棘手問題。目前從細胞中提取總RNA的方法很多，通常采用的方法有Trizol法、改良CTAB 法、SDS酸酚法、異硫氰酸胍-CTAB法、異硫氰酸胍-SDS法等，提取純度高、完整性好的mRNA是順利構(gòu)建cDNA文庫、RT-PCR以及EST序列分析等分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵[2-4]。為此，許多公司制定和生產(chǎn)了用于提取不同物種總RNA的方法和試劑盒，但不同物種細胞組織中所含的成分（多糖、多酚等）有很大差異，因此，不同方法和不同廠家的試劑盒間也各有優(yōu)缺點。

豬苓[Polyporus umbellatus（Pers.）Fr.] 是一種藥用大型真菌，在分類學(xué)上屬于無隔擔子菌亞綱（Holobasidiomycetidae）、 無褶菌目（Aphyllophorales）、 多孔菌科（Polyporaceae）、 多孔菌屬（Polyporus）。豬苓主要分布于我國陜西等西南省區(qū)和東北長白山區(qū)[5]。Xing等[6]通過分析比對nr DNA ITS和28s rRNA（LSU）序列認為豬苓的種群發(fā)源地應(yīng)是陜西省和甘肅省。豬苓的生長過程可分為菌絲體萌發(fā)、菌核生長和子實體形成三個階段。生長3年的菌核（黑苓）才可作為藥材，一般認為，豬苓菌核生長周期長，細胞趨于木質(zhì)化[7]，在菌核中會大量富集多糖、酚類等次生代謝產(chǎn)物。尤其是酚類物質(zhì)易被氧化成醌，與RNA不可逆地結(jié)合，增加了提取足夠質(zhì)量與純度的總RNA的難度。目前還少有關(guān)于從豬苓菌核中提取總RNA方法的文獻報道。筆者以產(chǎn)于陜西的豬苓菌核及菌絲體為試材，通過Trizol改良法和EASY Spin植物快速提取試劑盒法（簡稱試劑盒法）提取總RNA，探索提取豬苓菌核及菌絲體總RNA的最適方法，為后續(xù)構(gòu)建陜西豬苓菌核及菌絲體的cDNA文庫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料。

豬苓菌核為采自于陜西省佛坪縣的3年生黑苓，菌絲體采用組織分離法從豬苓菌核中分離獲得，再經(jīng)轉(zhuǎn)管活化和擴繁后保存于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物實驗室。

1.1.2 供試試劑。

1.1.2.1 RNA提取試劑。

TrizolReagent 購于Invitrogen公司；EASY Spin植物快速提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司。

1.1.2.2 其他試劑。

DEPC 購于Solarbio 公司；Advantage 2 PCR kit 購于Clontech 公司；其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 供試引物。

SMART ⅣTM Oligonucleotide（12 μmol/L）5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCG GG-3；CDS Ⅲ/3 PCR Primer（12 μmol/L）5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d（T）30N-1N-3。

1.2 方法

1.2.1 豬苓菌核及菌絲體中總RNA提取。

1.2.1.1 Trizol改良法[8]。

取1.5 mL預(yù)冷后EP管，分別加入80 mg 經(jīng)液氮研磨后的豬苓菌核及菌絲體粉末，經(jīng)1 mL Trizol試劑的裂解后，加入氯仿產(chǎn)生有機相，離心取上清后加入等體積的水飽和酚、三氯甲烷和異戊醇去除蛋白質(zhì)[9]，離心取上清后用異丙醇沉淀RNA[10]，離心去上清后由75% 乙醇清洗沉淀2～3 次，最后用DEPC水溶解沉淀。

1.2.1.2 試劑盒法。

參照EASY Spin 植物RNA快速提取試劑盒說明書的方法進行操作。

1.2.2 總RNA檢測。

用紫外分光光度法檢測提取總RNA的均一性；用1%瓊脂糖凝膠、TAE緩沖液電泳檢測所得總RNA的完整性。

1.2.3 豬苓菌核及菌絲體cDNA的合成。

1.2.3.1 cDNA第一鏈的合成。

向0.5 mL EP管中加入3 μL 總RNA、1 μL SMART ⅣTM Oligonucleotide、1 μL CDS Ⅲ/3 PCR Primer，瞬時離心。72 ℃孵育2 min，冰上冷卻2 min，瞬時離心。再按順序加入2 μL 5×FirstStrand Buffer、1 μL DTT（20 mmol/L）、1 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1 μL SMARTScribeTM MMLV Reverse Transcriptase，反應(yīng)體系為10 μL，輕輕混合。42 ℃水浴1 h，將管置于冰上終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA完整性檢測

采用2種提取方法都可以從豬苓菌核和菌絲體中提取出總RNA，由圖1和圖2的電泳結(jié)果可見，都出現(xiàn)了總RNA的28S、18S、5S這3條條帶。但是Trizol改良法的5S條帶拖尾現(xiàn)象比較嚴重，說明Trizol改良法提取的總RNA存在著降解問題，可能是RNase酶未去除干凈或溫度過高導(dǎo)致RNA單鏈斷裂，致使RNA降解；而試劑盒法提取出的RNA，3條帶比較清晰，意味著RNA沒有出現(xiàn)蛋白質(zhì)殘留或DNA污染等現(xiàn)象，而且28S的亮度約為18S的2倍，表明提取的總RNA完整性很高，沒有發(fā)生降解。

2.2 RNA均一性檢測

用紫外分光光度計測定OD260/280來檢驗所提取總RNA的均一性，當OD260/280值過小時，表明有蛋白質(zhì)或酚污染；當OD260/280值大于2.2時，意味著RNA已經(jīng)降解成單核酸了[10-11]。由表1可知，采用試劑盒法提取總RNA的OD260/280比值均為1.7～2.1，表明總RNA純度很高；而采用Trizol改良法提取總RNA的OD260/280比值大于22，表明總RNA已經(jīng)降解。但是，相比Trizol改良法，試劑盒法提取的總RNA產(chǎn)量偏低，推測是樣品在用基因組DNA清除柱清除殘留DNA時RNA的產(chǎn)量也嚴重降低。豬苓菌核中的總RNA產(chǎn)量明顯低于菌絲體中的總RNA產(chǎn)量，其原因可能是因為菌核處于休眠狀態(tài)，活性較弱，且菌核細胞趨于木質(zhì)化，裂解難度增大，導(dǎo)致總RNA產(chǎn)量比較低。

2.3 LD-PCR擴增cDNA

通過對豬苓菌核及菌絲體的cDNA合成和LD-PCR擴增，經(jīng)電泳檢測擴增產(chǎn)物，其結(jié)果見圖3、4。豬苓菌核和菌絲體的引物擴增條帶彌散分別分布在1 000～5 000 bp和750～2 500 bp，說明它們的cDNA擴增帶的豐度和長度均符合cDNA文庫構(gòu)建條件。

3 討論與結(jié)論

豬苓菌核細胞內(nèi)含有較多的多糖和麥角甾醇，而且其含量隨年份增加亦明顯升高，而用液體發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體多糖和麥角甾醇含量更是高于菌核[12]。豬苓菌核是由擬薄壁組織和疏絲組織形成的一種休眠體，是菌核貯藏養(yǎng)分的器官[13]，這些因素都明顯增加了豬苓菌核及菌絲體總RNA的提取難度。欒換東等[14]采用Trizol法、Trizol改良1法、Trizol改良2法及CTAB改良法對長白山豬苓菌絲體總RNA的提取結(jié)果表明，Trizol法存在多糖多酚污染，影響了RNA的完整性，CTAB改良法耗時較長，產(chǎn)率比較低，Trizol改良1法、Trizol改良2法提取的總RNA無論是完整性還是純度均較Trizol法與CTAB改良法好。秦亞麗[15]分別采用Trizol試劑法、RNAiso plus法、RNAiso plus搭配RNAisomate for Plant Tissue法、CTABLiCl法及Trizol Reagent法共5種方法對陜西豬苓菌絲體總RNA進行提取，結(jié)果表明CTAB法與Trizol Reagent法所提出的RNA產(chǎn)率低，且OD260/280也達不到要求；Trizol法與RNAiso plus法雖得出了明顯的條帶，但存在蛋白質(zhì)或多糖污染，而RNAiso plus搭配RNAisomate for Plant Tissue法經(jīng)改良后得到的RNA質(zhì)量和產(chǎn)量都很好。

鑒于豬苓菌核特殊的結(jié)構(gòu)和在提取總RNA時出現(xiàn)的困難，筆者認為需要注意以下幾點：①加入裂解液前要保證豬苓樣品一直處于冷凍的狀態(tài)；②針對豬苓菌核難提取易降解的情況，可適當增加裂解液的量并延長裂解液與豬苓樣品接觸的時間；③用提前預(yù)熱到75～85 ℃的RNasefree H2O溶解RNA，這些可以在一定程度上提高總RNA產(chǎn)量。

該研究采用了Trizol改良法和試劑盒法2種不同的方法提取豬苓菌核和菌絲體的總RNA。Trizol試劑作為普遍的RNA提取試劑，雖然成功率高，但所得總RNA純度較低，完整性較差，易降解；而試劑盒法比較簡便，且提取時間短，通常30 min就可以完成，所得RNA純度比較高，完整性也較好。

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