唐仕娟，劉 佳，郭子坤，石成才，王智飛，張樹(shù)武，徐秉良

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

向日葵(HelianthusannuusL.)由于其籽實(shí)含油量高及其秸稈可作為生物能源，已成為世界第四大油料作物[1-3]，全世界年產(chǎn)量達(dá)4734.5萬(wàn)t，中國(guó)種植總面積為95.902萬(wàn)hm2。由于諸多病害的發(fā)生，向日葵產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到嚴(yán)重限制，其中由核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的菌核病是造成向日葵產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要病害之一，世界各地向日葵種植區(qū)均有發(fā)生[4]。研究表明，核盤菌可以侵染向日葵葉片、莖基部、根部和花盤等部位，花盤受害后品質(zhì)下降，產(chǎn)量降低，損失嚴(yán)重[5-6]。據(jù)報(bào)道，在中國(guó)向日葵菌核病發(fā)生地塊，一般可減產(chǎn)30%左右[7]。民勤縣作為甘肅省向日葵主栽區(qū)，近年來(lái)菌核病發(fā)生愈來(lái)愈嚴(yán)重，如2016年該病導(dǎo)致民勤縣向日葵減產(chǎn)10%～30%，個(gè)別嚴(yán)重地塊減產(chǎn)高達(dá)80%[8]。

研究表明，菌核作為向日葵菌核病菌度過(guò)不良環(huán)境的重要形態(tài)[9]和主要初侵染源，在干旱土壤中可存活8a之久[10]。Hao等[11]發(fā)現(xiàn)菌核侵染寄主的主要方式有直接萌發(fā)形成菌絲體侵入植物內(nèi)部，以及萌發(fā)形成子囊盤后釋放出子囊孢子，并借助媒介侵入寄主植物。有關(guān)菌核萌發(fā)形成子囊盤的報(bào)道較多，于淑怡等[12]研究表明，溫度和濕度適宜時(shí)菌核可萌發(fā)出子囊盤柄，光照條件下菌核可萌發(fā)形成成熟的子囊盤。Mila等[13]研究表明，土壤中的水分是影響菌核子囊盤型萌發(fā)的重要因素，土壤干燥時(shí)菌核無(wú)法萌發(fā)形成子囊盤。Nepal等[14]研究表明菌核吸水量與其子囊盤的萌發(fā)密切相關(guān)，當(dāng)含水量較高時(shí)，菌核的萌發(fā)率越大，形成子囊盤數(shù)量也越多。同時(shí)，菌核可直接萌發(fā)形成菌絲侵入植物內(nèi)部，韓月泠等[15]發(fā)現(xiàn)人參核盤菌菌核在自然條件下容易直接萌發(fā)出菌絲，但未吸收水分時(shí)無(wú)法萌發(fā)形成菌絲，土壤濕度對(duì)其萌發(fā)菌絲影響較大。母紅巖等[16]發(fā)現(xiàn)土壤濕度越小、菌核齡期越大越不利于其直接萌發(fā)形成菌絲。Huang等[17]研究發(fā)現(xiàn)菌核土壤中進(jìn)行菌絲萌發(fā)，產(chǎn)生的菌絲可以感染向日葵幼苗的根和下胚軸，而其花盤部分感染是由子囊孢子引起的。另外，在自然環(huán)境中菌核形成極易受濕度、溫度和通風(fēng)情況等環(huán)境因素影響[18]，營(yíng)養(yǎng)、光照和pH等條件是齊整小核菌菌核形成的關(guān)鍵因素[19]。

影響向日葵菌核病菌菌核萌發(fā)特性及菌核形成的主要因素尚未報(bào)道，本研究以從甘肅民勤向日葵種植地區(qū)分離的核盤菌形成的菌核為研究對(duì)象，探究不同條件對(duì)向日葵菌核菌絲型萌發(fā)和菌絲型萌發(fā)后形成菌核的影響，旨在為菌核病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

將采集、分離自甘肅民勤并保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)接種于PDA平板中央活化培養(yǎng)2 d后(25 ℃恒溫培養(yǎng)箱，12 h/d光照培養(yǎng))，挑取培養(yǎng)基邊緣菌絲轉(zhuǎn)接于新的PDA平板，待培養(yǎng)14 d后(菌核成熟)挑選大小一致菌核取出晾干，室溫保存，備用。

1.2 方 法

1.2.1 菌核消毒處理 菌核用75%酒精浸泡 15 s，轉(zhuǎn)移至4%NaClO溶液浸泡3 min，無(wú)菌水重復(fù)漂洗3次，無(wú)菌濾紙吸干表面水分，收集， 備用。

1.2.2 溫度對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性及菌核產(chǎn)生量影響 將消毒處理的菌核接種于PDA培養(yǎng)基中央，每皿接種1個(gè)菌核，并分別置于溫度為5、10、15、20、25、30、35和40 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待培養(yǎng)3 d后，觀察菌核萌發(fā)形成菌絲的情況，每隔1 d測(cè)量菌落直徑，培養(yǎng)14 d后記錄菌核數(shù)量。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.2.3 pH對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性及菌核產(chǎn)生量影響 制備pH分別為4、5、6、7、8、9和10的PDA培養(yǎng)基，將菌核接種于不同pH PDA培養(yǎng)基中央，每皿接種1個(gè)菌核。置于光照培養(yǎng)箱(溫度為25 ℃、光照時(shí)長(zhǎng)為12 h/d)培養(yǎng)。菌核萌發(fā)、菌落直徑及菌核數(shù)量記錄方法同“1.2.2”，每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.2.4 不同光照條件對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性及菌核產(chǎn)生量影響 將菌核置于 PDA 培養(yǎng)基中央，每皿接種1個(gè)菌核，分別置于不同光照條件培養(yǎng)(24 h/d光照、0 h/d光照、12 h/d光照、紫外照射2 h+24 h/d光照、紫外照射2 h+0 h/d光照)。菌核萌發(fā)、菌落直徑及菌核數(shù)量記錄方法同“1.2.2”，每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.2.5 不同碳源、氮源對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性及菌核產(chǎn)生量影響 根據(jù)Czapek培養(yǎng)基的配方，按照相同的比例加入不同種碳源，分別以蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖和甘露醇作為碳源，以硝酸鈉、硝酸銨、尿素、硝酸鉀、蛋白胨和氯化銨作為氮源制備不同碳源和氮源培養(yǎng)基，并以不添加碳源、氮源培養(yǎng)基作為對(duì)照。然后，將備用菌核置于 PDA 培養(yǎng)基中央，每皿接種1個(gè)菌核，置于培養(yǎng)箱(溫度為25 ℃、光照時(shí)長(zhǎng)為12 h/d)培養(yǎng)。菌核萌發(fā)、菌落直徑及菌核數(shù)量記錄方法同“1.2.2”，每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.2.6 溫度對(duì)菌核致死活性的影響 采用恒溫水浴處理法測(cè)定溫度對(duì)菌核致死活性的影響。將菌核置于裝有5 mL無(wú)菌水的10 mL無(wú)菌離心管中，并利用水浴鍋對(duì)其進(jìn)行不同溫度處理，處理溫度分別為45、50、55、60、65、70、75和80 ℃，處理時(shí)間為10 min。經(jīng)處理后置于無(wú)菌濾紙晾干，并接種于PDA平板中央，每皿接種1個(gè)菌核，每個(gè)處理5皿。分別置于25 ℃、光照時(shí)長(zhǎng)為12 h/d的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后觀察菌核萌發(fā)情況，每隔1天觀察1次，連續(xù)觀察7 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)并繪制圖表，采用SPSS 21.0軟件和Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)后菌落生長(zhǎng)及菌核產(chǎn)生量影響

結(jié)果表明，在5～30 ℃時(shí)菌核均可進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，最適宜菌核菌絲型萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的溫度為20～25 ℃，培養(yǎng)6 d后菌核萌發(fā)菌絲形成的菌落直徑均可達(dá)85 mm。溫度對(duì)形成的菌核大小和數(shù)量均有影響，在適宜溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)形成的菌核數(shù)量較多，其中25 ℃下培養(yǎng)所形成的菌核數(shù)最多。當(dāng)溫度低于20 ℃時(shí)形成的菌核數(shù)量會(huì)減少，然而，形成的菌核較大，直徑可達(dá)6 mm左右；當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃及以上時(shí)無(wú)法形成菌核(表1)。

表1 不同溫度下菌核菌絲型萌發(fā)及形成菌核情況Table 1 Germination of hyphae from sclerotia and sclerotia formation of S.sclerotium at different temperatures

2.2 pH對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性及菌核產(chǎn)生量的影響

培養(yǎng)基pH在4～10時(shí)菌核均可進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，且隨著pH增大，菌核萌發(fā)時(shí)間越長(zhǎng)，菌落生長(zhǎng)速度越慢(圖1-A)。培養(yǎng)基pH在4～9時(shí)菌核萌發(fā)菌絲后均可形成菌核，且隨著pH的增大形成的菌核數(shù)逐漸減少。當(dāng)培養(yǎng)基pH為4時(shí)形成的菌核最多，且與pH ≥ 5的處理間均存在顯著差異，pH為10時(shí)，菌核萌發(fā)菌絲后無(wú)法形成菌核(圖1-B)。

2.3 光照對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性及菌核產(chǎn)生量的影響

光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)及菌核形成有顯著影響，光照時(shí)間越長(zhǎng)菌核萌發(fā)后菌絲生長(zhǎng)速度越快，在24 h/d光照培養(yǎng)時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度最快，黑暗培養(yǎng)的菌落生長(zhǎng)最慢。紫外照射對(duì)菌核的菌絲型萌發(fā)無(wú)顯著抑制作用(圖2-A)。24 h/d光照培養(yǎng)形成的菌核數(shù)量最多，平均每皿可形成18個(gè)菌核，與其他處理間差異顯著。紫外照射后形成的菌核數(shù)略少于未經(jīng)紫外照射的處理(圖2-B)。

2.4 碳源對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性及菌核產(chǎn)生量的影響

結(jié)果表明，添加不同種類的碳源對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性和萌發(fā)后菌核的形成有顯著影響。培養(yǎng)4 d、5 d和6 d后，與對(duì)照相比，蔗糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖做碳源時(shí)，菌核萌發(fā)后菌落直徑均與對(duì)照差異顯著(圖3-A)。添加乳糖作為碳源時(shí)，形成的菌核最多，平均每皿可形成14個(gè)菌核，顯著高于添加其他碳源。然而，添加甘露醇為碳源時(shí)，形成的菌核數(shù)量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，均形成少量菌核(圖3-B)。

2.5 氮源對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性及菌核產(chǎn)生量的影響

結(jié)果表明，氮源的種類對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)活性和萌發(fā)后菌核的形成有顯著影響。蛋白胨是最適宜菌核萌發(fā)后菌落生長(zhǎng)的氮源，且在培養(yǎng)4 d和5 d 后，形成的菌落直徑顯著高于其他組處理，而尿素作為碳源時(shí)，菌落直徑均顯著小于其他組處理(圖4-A)。添加硝酸銨為氮源時(shí)形成的菌核最多，平均每皿可形成24個(gè)菌核，形成的菌核數(shù)量顯著高于其他處理。不添加氮源時(shí)無(wú)法形成菌核，添加尿素為碳源時(shí)，形成的菌核數(shù)量與對(duì)照間無(wú)顯著差異，僅形成少量菌核(圖4-B)。

2.6 溫度對(duì)菌核致死活性的影響

結(jié)果表明，不同溫度處理后培養(yǎng)7 d對(duì)菌核致死活性具有顯著影響，其中當(dāng)水浴處理溫度為45 ℃和50 ℃時(shí)，菌核萌發(fā)形成的菌落直徑達(dá)85 mm。水浴處理溫度大于50 ℃對(duì)菌核的萌發(fā)具有顯著影響，在水浴處理溫度為55 ℃、60 ℃、 65 ℃和70 ℃時(shí)，菌落直徑分別為25.83 mm、20 mm、12.33mm和0 mm，顯著小于45 ℃和50 ℃處理后培養(yǎng)的菌落直徑，尤其當(dāng)溫度為70 ℃處理10 min時(shí)，菌核未能萌發(fā)形成菌絲(圖5)。

3 結(jié)論和討論

本研究發(fā)現(xiàn)在5～30 ℃時(shí)菌核均可進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，最適宜其萌發(fā)的溫度為20～25 ℃，35 ℃及以上溫度培養(yǎng)時(shí)，菌核無(wú)法進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，且10 ℃及以下溫度培養(yǎng)時(shí)，菌核萌發(fā)菌絲較慢，培養(yǎng)5 d才可見(jiàn)菌核萌發(fā)形成菌絲。母紅巖等[16]研究表明油菜菌核菌絲型萌發(fā)的最適溫度為20～27.5 ℃，10 ℃以下和30 ℃以上均不利于菌核進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，與本研究結(jié)論基本一致。李國(guó)慶等[12]研究表明，不同溫度下生長(zhǎng)的菌核萌發(fā)具有多樣性，本研究中溫度對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)的速度和萌發(fā)后形成的菌核數(shù)量及大小有顯著影響。本研究中低溫下菌核可進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，而母紅巖等[16]的研究中，在第11天時(shí)，10 ℃培養(yǎng)的菌核未見(jiàn)萌發(fā)，這可能與菌核的來(lái)源和本研究為菌核提供營(yíng)養(yǎng)刺激(即在培養(yǎng)基上培養(yǎng))有關(guān)。

有研究[20]表明，核盤菌分泌的草酸是其致病過(guò)程中的重要因子，為核盤菌侵染提供酸性環(huán)境，因而核盤菌對(duì)pH的適應(yīng)能力較為廣泛。本研究發(fā)現(xiàn)菌核菌絲型萌發(fā)對(duì)pH的適應(yīng)范圍也較為廣泛，在培養(yǎng)基pH為4～10時(shí)菌核均可進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，酸性條件更有利于菌核進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，這與母紅巖等[16]研究結(jié)果一致。隨著pH增大，菌核數(shù)量越來(lái)越少，當(dāng)培養(yǎng)基pH為10時(shí)，菌核進(jìn)行菌絲型萌發(fā)后無(wú)法再形成菌核，這與Rollins 等[21]報(bào)道堿性條件下菌核形成受到抑制的結(jié)論一致。

劉勇等[22]研究報(bào)道，紫外線照射能夠刺激菌核子囊盤型萌發(fā)，本研究中發(fā)現(xiàn)紫外光照射對(duì)菌核的菌絲型萌發(fā)沒(méi)有顯著刺激作用。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)光照時(shí)間越長(zhǎng)菌核越容易進(jìn)行菌絲型萌發(fā)。相關(guān)研究表明菌核的堅(jiān)固結(jié)構(gòu)可以抵御外界不良環(huán)境，例如：紫外線照射、高溫、干旱等[23]，本研究發(fā)現(xiàn)紫外光照射2 h后菌核仍可進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，這可能與菌核的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

關(guān)于碳源和氮源對(duì)菌核菌絲型萌發(fā)的研究較少，本研究中培養(yǎng)基不添加碳源和氮源時(shí)菌核均能進(jìn)行菌絲型萌發(fā)，但不添加碳源或氮源時(shí)，幾乎無(wú)法形成菌核。部分碳源和氮源會(huì)抑制菌核菌絲型萌發(fā)后形成菌核，如甘露醇和尿素，其原因有待進(jìn)一步研究。另外，菌核對(duì)不良環(huán)境因素有一定的耐受力，本研究中向日葵菌核的致死溫度高達(dá)70 ℃(水浴10 min)，與王瑋[24]研究的辣椒菌核病菌形成菌核的致死溫度相同。因此，本研究明確了不同溫度、pH、光照條件、碳源和氮源對(duì)向日葵菌核菌絲型萌發(fā)的影響，但其他因素促使菌核菌絲型萌發(fā)的條件和機(jī)理有待進(jìn)一步研究。