羊肚菌菌核人工栽培實驗研究*

汪建文，鄧春英，洪 江

(貴州科學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

0 引言

羊肚菌(Morehellaspp.)是一類稀有的腐生和菌根菌兼性真菌，屬于盤菌綱(Discomycetes)羊肚菌科(Morohellaceae)羊肚菌屬，具有較高的食用和藥用價值。在羊肚菌人工栽培技術(shù)中有幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：菌種、外援營養(yǎng)袋、出菇管理。1982年，羅納德·奧維爾(Ronald D.Ower)開展了羊肚菌人工控制下的栽培實驗，采用不同營養(yǎng)的層級基質(zhì)培養(yǎng)出菌核，并以菌核為種進行栽培，培育出羊肚菌子實體[1-4]，從此，菌核的形態(tài)及其功能作用引起了廣泛關(guān)注。菌核被認為是羊肚菌子實體形成過程中的關(guān)鍵要素[5]，但其中的外援營養(yǎng)袋技術(shù)被忽視，文獻報道大部分重復(fù)Ower的實驗很難成功[6-8]。隨著我國羊肚菌大田栽培的成功，突現(xiàn)出外援營養(yǎng)袋的重要作用，但對菌核的作用仍然不明，存在諸多分歧，據(jù)報道除了極少數(shù)種類的羊肚菌沒有菌核外，羊肚菌屬的大多數(shù)種類都會產(chǎn)生菌核[9-10]，但是在野生條件下又很少能發(fā)現(xiàn)羊肚菌菌核的存在[11]，因此，對于羊肚菌菌核作用如何，很有必要開展進一步的研究。本文通過采用Ower等人廣口瓶相近的方法對兩種羊肚菌進行菌核人工培養(yǎng)，并以其中產(chǎn)生較大菌核的七妹羊肚菌核為種進行栽培試驗研究，探討羊肚菌菌核功能作用，以及和外援營養(yǎng)的關(guān)系，為羊肚菌的菌種繁育和生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料及方法

1.1 材料

分別采用六妹羊肚菌原種MS12和七妹羊肚菌原種C7(貴州綠鑫源農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司)，用不同培養(yǎng)基對兩種羊肚菌進行菌核生成實驗，并以產(chǎn)生的菌核為種，進行羊肚菌栽培實驗。

1.2 試驗方法

用原種菌絲或培養(yǎng)后的菌核為種進行接種；接種廣口瓶放置在陰暗室內(nèi)培養(yǎng)菌核，濕度60%～80%，溫度在12～15 ℃。

(1)以麥粒和玉米粒為主要營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)，用廣口瓶法產(chǎn)生菌核，廣口瓶容積為480 mL，以觀察不同培養(yǎng)料對菌核形成的影響。

(2)以麥粒為主要營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)，廣口瓶容積為480 mL，培養(yǎng)基質(zhì)分別占到40%、60%、80%，其余土壤分別占到60%、40%、20%，用廣口瓶法形成菌核，對比不同富營養(yǎng)物占比對菌核形成的影響。

(3)以麥粒為主要營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)和土壤50%∶50%均勻混合，用容積240 mL和480 mL的廣口瓶形成菌核，以觀察菌核產(chǎn)量及容器大小對菌核形成的影響。

(4)以方法(3)中產(chǎn)生的菌核為菌種，于第1年12月初，種植于30 cm×40.5 cm×7 cm的框中，菌核覆土深2 cm左右，pH7～8，土壤含水量在40%左右，氣溫12～16 ℃，置于室外，空氣濕度保持在80%～90%。分別進行了以麥粒為主要原料的營養(yǎng)袋栽培方式和只用菌核而無營養(yǎng)袋的栽培方式的出菇對比試驗。

2 結(jié)果

在菌核培養(yǎng)過程中，玻璃罐接種后菌絲生長迅速，在15 ℃左右的溫度下7～8 d長滿接種罐，在11～12 d時從罐子上部開始生成菌核。發(fā)現(xiàn)以麥粒和玉米粒為主要營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)相比，麥粒營養(yǎng)基質(zhì)能產(chǎn)生更多的菌核(圖1)。

在營養(yǎng)基質(zhì)與土壤分層培養(yǎng)的情況下，菌核主要是在土壤層中形成，菌核密度相近，培養(yǎng)基質(zhì)與土壤占到40%∶60%的方式中能得到更多的菌核(圖2)；而用麥粒為主要營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基質(zhì)和土壤以50%∶50%均勻混合的不分層方式，整個接種罐中都產(chǎn)生菌核、菌核與土壤相結(jié)合，總量最多(圖3)；以不同容積的罐子產(chǎn)生菌核的時間有差別，容積為240 mL的產(chǎn)生菌核的時間更早(圖4)。

圖2 不同比例營養(yǎng)物產(chǎn)生的菌核Fig.2 Sclerotia produced by different proportions of nutrients

圖3 50%土壤與50%營養(yǎng)物質(zhì)混合比例所產(chǎn)生的菌核Fig.3 Sclerotia produced by the mixture of 50%soil and 50% nutrients

圖4 不同容積的培養(yǎng)瓶產(chǎn)生的菌核Fig.4 Sclerotia produced by culture bottles with different volumes

兩種菌株都極易產(chǎn)生菌核，C7(七妹羊肚菌)形成較大的菌核，塊狀，形狀不規(guī)則，與土壤結(jié)合，直徑可達2～4 cm；C12/MS(六妹羊肚菌)形成較小的菌核，直徑在0.5 cm左右，數(shù)量多，分布均勻(圖5)。

圖5 兩種羊肚菌產(chǎn)生的菌核Fig.5 Sclerotia produced by two Morchella species

在土壤中栽培菌核前，在水中浸泡12～24 h，菌核吸水性不強，重量幾乎不變，浸泡后或沒有浸泡的菌核在濕潤的空氣中或埋于土壤中都很容易萌發(fā)，1～2 d就可長出菌絲。1 ℃下放置于冰箱中，1個月后取出，同樣在濕潤的空氣中或埋于土壤中都很容易萌發(fā)。

選擇產(chǎn)生較大菌核的C7(七妹羊肚菌)的菌核作為菌種加上外援營養(yǎng)袋進行盆栽實驗，成功培養(yǎng)了子實體(圖6)，生長過程與麥粒種生長過程相似。第1年12月上旬，菌核種植于30 cm×40.5 cm×7 cm的框中，菌核用量在300 mL左右，菌核覆土2 cm，菌核易萌發(fā)，5～7 d菌絲長出地面，在土壤表層放置以麥粒為主要原料的營養(yǎng)袋，外援營養(yǎng)袋的土壤層中以及與罐體接觸的種植土壤中易形成菌核，隨后土壤表面產(chǎn)生分生孢子，在土壤表層菌絲變黃后，去除營養(yǎng)袋，澆出菇水，第2年的2月初出現(xiàn)原基，之后溫度保持在10～16 ℃，濕度在80%～90%，3月中旬出菇。

圖6 七妹羊肚菌菌核盆栽后產(chǎn)生子實體Fig.6 Fruiting bodies of Morchella septimelata by pot culture

同時進行了只用菌核而不使用營養(yǎng)袋栽培方式的對比試驗，菌核用量在600 mL左右。在菌核定植于土壤1周后(Ower專利的方法)，以及在土壤表層出現(xiàn)分生孢子及菌絲變黃后，澆出菇水，均未出現(xiàn)原基。

3 討論

3.1 菌核的形成

真菌菌核有“真菌核”和“菌核樣結(jié)構(gòu)”之分，“真菌核”通常由外向內(nèi)依次是外皮層、皮質(zhì)層和髓質(zhì)層，而“菌核樣結(jié)構(gòu)”的假菌核，是由密集未分化的菌絲組成，包括一些菌絲結(jié)構(gòu)將土壤或樹枝結(jié)合在一起，與根莖和落葉之間形成粘連，有許多真菌還將部分基質(zhì)封閉在著色的厚壁細胞層內(nèi)[12]。菌核通常在菌絲被切斷、撕裂、緊貼著培養(yǎng)容器的邊緣生長或與各種化學(xué)屏障(包括變質(zhì)產(chǎn)物或特定形態(tài)發(fā)生物質(zhì))接觸時引起，或在與其他微生物，揮發(fā)性或可擴散的化學(xué)物質(zhì)的相互作用也可能引起菌核的發(fā)生[13]。

羊肚菌菌核被認為是未分化的假菌核。在人工設(shè)定的玻璃罐環(huán)境中培養(yǎng)菌核，形成了屏障作用，通常在延罐的邊緣上生長更多的菌核，在小石子的周圍也常發(fā)現(xiàn)菌核的生成，這些物理屏障的地方促使了菌核的生成。

在采用玻璃罐方式培養(yǎng)菌核，形成屏障作用的同時，也營造缺氧的環(huán)境，可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進了菌核的形成。何培新等研究[14]，氧化應(yīng)激反應(yīng)也可能是誘導(dǎo)羊肚菌菌核發(fā)生的重要原因，氧化應(yīng)激會誘導(dǎo)多種真菌菌核分化，通過形成菌核規(guī)避氧氣，阻止超氧化狀態(tài)的發(fā)展，避免對細胞產(chǎn)生更大的損傷，代謝中的多酚氧化酶也起著作用，使碳水化合物或菌絲表面的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，通過單個菌絲的交聯(lián)將它們結(jié)合在一起，從而使小的菌絲聚集發(fā)展而成為菌核。

在我們的實驗中，由于種的不同，C7(七妹羊肚菌)形成較大的菌核，形狀不規(guī)則，塊狀，與土壤結(jié)合，直徑可達2～4 cm；MS12(六妹羊肚菌)形成較小的菌核，直徑在0.5 cm左右。兩個種的菌核均很容易形成，并與土壤結(jié)合在一起，土壤中的無機鹽可能促進了菌核的形成，任愛梅等在研究不同培養(yǎng)基對菌核形成的影響時發(fā)現(xiàn)[15]，培養(yǎng)基無機鹽濃度過高會使細胞外壓升高，對細胞造成一定的影響，這可能是刺激菌核形成的條件之一。在保證菌絲正常生長的情況下，培養(yǎng)基內(nèi)無機鹽濃度越高越利于菌核的形成。

以麥粒為主的基質(zhì)比玉米粒為主的基質(zhì)有更好的生長，并有更多的菌核生成，這可能是以玉米為主要原料的基質(zhì)的玉米是玉米粗粒，在蒸過后，由于糖分的作用，很容易粘聯(lián)在一起，影響透氣性，從而影響了菌絲生長和菌核的形成。

層級的方式形成了營養(yǎng)梯度，營養(yǎng)菌絲體和構(gòu)成營養(yǎng)庫的菌核原基之間膨脹梯度的變化，導(dǎo)致有機碳水化合物的流動，也可能是引發(fā)菌核發(fā)生的原因之一[16]，在層級培養(yǎng)方式中，土壤層相當(dāng)于是貧側(cè)營養(yǎng)層，與富營養(yǎng)層形成營養(yǎng)梯度。Amir等人在1994年確定了羊肚菌菌核形成的兩個基本條件，即菌絲頂端生長所需的高膨脹勢和能量代謝產(chǎn)生的膨脹勢；在對分離平板中羊肚菌菌核形成的研究中，接種于貧側(cè)營養(yǎng)基的接種物向富側(cè)營養(yǎng)基生長，最終主要在貧側(cè)產(chǎn)生菌核，在此過程中，營養(yǎng)物傳輸方向發(fā)生了變化，即在菌落延伸過程中，營養(yǎng)傳輸朝著菌絲體的菌絲尖端，當(dāng)菌絲體到達平板邊緣時，由于菌核的形成，轉(zhuǎn)運速度遠大于營養(yǎng)物質(zhì)的利用，菌核形成了庫的作用。

在以層級方式的罐中產(chǎn)生的菌核，并非營養(yǎng)物越多就產(chǎn)生越多的菌核，我們觀察到在40%的營養(yǎng)物時能產(chǎn)生更多的菌核，營養(yǎng)物太多，促進了菌絲生長，也許在40%的營養(yǎng)物中已足夠產(chǎn)生菌核的營養(yǎng)供給。而在運用營養(yǎng)物與土壤50%比例混合時更易產(chǎn)生菌核，這也許是創(chuàng)造了更多的微小的層級方式。

3.2 菌核的功能和作用

在菌核科成員菌核發(fā)育過程中，菌核中發(fā)現(xiàn)的主要細胞質(zhì)儲備是糖原、蛋白質(zhì)、多聚磷酸鹽和脂類，大量的內(nèi)源儲備積累起來，這些儲備連同壁和菌絲間的物質(zhì)一起，被用來維持菌核在存活期間的生長消耗，并最終在萌發(fā)過程中被利用。劉偉等對梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)開展了從營養(yǎng)菌絲體階段(VM)、初始菌核階段(IS)和成熟菌核階段(MS)的完整和全面的轉(zhuǎn)錄組研究，檢測到通過基因表達聚類鑒定的差異表達基因(DEGs)主要涉及能量代謝，而碳水化合物的分解代謝主要發(fā)生在營養(yǎng)菌絲階段，富含能量的物質(zhì)的合成代謝是梯棱羊肚菌菌絲生長和菌核形態(tài)發(fā)生的主要事件[17]。2018年，何培新等通過透射電鏡觀察到菌絲和菌核細胞中有大量的脂滴，其數(shù)量在菌核細胞中多于營養(yǎng)菌絲并證明羊肚菌菌絲和菌核中富含能量的物質(zhì)是脂類物質(zhì)，脂的積累從菌核形成的第3個階段逐漸升高[18]。

我們運用Ower的近似方法產(chǎn)生菌核，利用菌核作菌種，采用外援營養(yǎng)袋的方法，成功培育出子實體，說明菌核作為菌種，經(jīng)覆土，作為一種改良的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，以菌核自身的營養(yǎng)作養(yǎng)分萌發(fā)營養(yǎng)菌絲，通常1個星期會長出土壤層，這時土壤中的養(yǎng)分不足(若沒有外援營養(yǎng)物質(zhì)，菌絲長勢緩慢，菌絲稀疏)，需添加外援營養(yǎng)物質(zhì)以供菌絲生長，菌絲長入外援營養(yǎng)袋中，通過菌絲的轉(zhuǎn)運作用，把營養(yǎng)物質(zhì)傳輸?shù)酵寥缹拥木z中，在羊肚菌本身的遺傳性和外界條件下達到生殖生長，出現(xiàn)子實體原基，在適宜的生長條件下長成子實體。

但只運用菌核作菌種按Ower專利的方法卻沒有成功，菌核萌發(fā)了菌絲，通過催菇方法如澆水沒有觸發(fā)生殖生長，這也從反面體現(xiàn)出了外援營養(yǎng)的作用，或許是外部條件沒有掌握，或是菌核量不夠，特別是還沒有認識到羊肚菌菌核脂類積累物的利用機制，因此還有待進一步對菌核萌發(fā)后營養(yǎng)利用問題以及在菌絲轉(zhuǎn)入生殖生長中的作用和環(huán)境條件進行深入研究。