譚東　庹德財(cái)　沈文濤　言普　黎小瑛　周鵬

摘 要 為研究番木瓜畸形花葉病毒（PLDMV）hc-pro基因保守基序FRNK對(duì)病癥表現(xiàn)的影響，本研究采用定點(diǎn)突變的方法，獲得了PLDMV-DF的hc-pro基因保守基序FRNK的精氨酸（R）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）的突變體克隆p35S-PLDMV-GFP-R183/I，該位點(diǎn)突變顯著減輕了PLDMV在番木瓜上的病癥表現(xiàn)，表明是影響其致病性的關(guān)鍵位點(diǎn)。本研究結(jié)果為利用交叉保護(hù)防控番木瓜畸形花葉病毒病提供了重要參考和材料。

關(guān)鍵詞 番木瓜；木瓜畸形花葉病毒；突變；侵染性克?。话Y狀表現(xiàn)

中圖分類號(hào) S668.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To investigate the effect of the hc-pro gene conserved FRNK motif in Papaya leaf distortion mosaic virus （PLDMV）， we used the Hainan severe strain PLDMV-DF carrying a green fluorescent protein （gfp） gene as a model virus （denoted as p35S-PLDMV-GFP） to generate a mutant clone of p35S-PLDMV-GFP-R183/I， which contained the substitution of Ile for Arg at position 183 in the conserved FRNK motif of PLDMV，which could cause a dramatic symptom change from severe to mild in papaya. The site mutation significantly reduced the expression of PLDMV in papaya， indicating that it is the key point affecting its pathogenicity. The results of this study would provide important references and materials for cross-protection against papaya terato-mosaic virus disease.

Key words papaya； Papaya leaf distortion mosaic virus； mutation； infectious clone； symptom expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.018

番木瓜（Carica papaya L.）是海南重要的熱帶經(jīng)濟(jì)果樹，由于受病蟲害等多種因素的影響，導(dǎo)致番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展一直不景氣。一直以來，番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是其最主要的限制因素[1]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在番木瓜育種上的成功應(yīng)用，對(duì)PRSV的防治具有重要意義，抗PRSV轉(zhuǎn)基因番木瓜品種的得到大面積推廣種植。但是海南番木瓜種植業(yè)面臨著一種新的番木瓜畸形花葉病毒（papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）的威脅，且逐漸上升為主要病害[2-3]。PLDMV和PRSV同屬于馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬病毒。目前，很難通過化學(xué)防治的方法對(duì)PLDMV進(jìn)行防控，主要以清除病株及防治媒介昆蟲為主。雖然臺(tái)灣中興大學(xué)已培育出同時(shí)抗PRSV和PLDMV的雙抗轉(zhuǎn)基因番木瓜[4]，但仍未見生產(chǎn)應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。此外，由于各地區(qū)病毒株存在差異，導(dǎo)致一個(gè)地區(qū)的轉(zhuǎn)基因植物在另一地區(qū)種植表現(xiàn)出的抗病能力減弱甚至抗性喪失，這使得目前這種利用病毒來源基因介導(dǎo)抗性的策略在生產(chǎn)應(yīng)用上受到很大限制。且由于公眾出于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和食品安全性的考慮，抗病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜的應(yīng)用仍然受到極大地限制。因此，急需尋找廣譜安全的抗病毒新策略。

PLDMV是單分體正義RNA（+ssRNA）病毒，基因組大小約10 kb（不包括poly A部分），由一個(gè)大的開放閱讀框（ORF）和一個(gè)小的ORF組成，經(jīng)加工共編碼11個(gè)成熟蛋白（P1、HC-Pro、P3、6K1、PIPO、CI、6K2、Vpg、NIa-Pro、NIb和CP）[3]。HC-Pro蛋白是馬鈴薯Y病毒屬病毒蛋白中研究最多的一個(gè)多功能蛋白，其命名來自首次鑒定出具有蚜蟲傳播的輔助成分（helper component，HC）功能，此外，HC-Pro蛋白還具有水解自身C端的半胱氨酸蛋白酶活性和RNA沉默抑制子等功能[4-5]。HC-Pro蛋白可分為N端（約100個(gè)氨基酸）、中間區(qū)域（約250個(gè)氨基酸）和C端（約100個(gè)氨基酸）3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域，N端主要與蚜蟲傳播相關(guān)，C端主要具有蛋白酶水解活性，而中間區(qū)域是與RNA沉默抑制子等相關(guān)的多功能區(qū)[6-8]。目前有大量關(guān)于馬鈴薯Y病毒的hc-pro基因上的保守基序FRNK與致病性相關(guān)的研究報(bào)道[9-11]，當(dāng)FRNK的R（精氨酸）突變?yōu)镮（異亮氨酸）時(shí)會(huì)成為弱毒株，嚴(yán)重減輕在植株上的病癥表現(xiàn)，且對(duì)強(qiáng)毒株具有較好的交叉保護(hù)效果。因此，本研究利用Gibson拼接法將PLDMV的hc-pro基因上的保守基序FRNK的精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，獲得在番木瓜植株上病癥明顯減弱的突變體克隆p35S-PLDMV-GFP-R183/I，為后續(xù)利用交叉保護(hù)策略防控PLDMV提供重要材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒源和供試植物 毒株P(guān)LDMV-DF（GenBank登錄號(hào)：JX974555）由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存，并構(gòu)建了在nib/cp之間插入gfp基因的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP[12]。本研究在非轉(zhuǎn)基因番木瓜（Solo）植株上進(jìn)行突變體克隆的鑒定。

1.1.2 菌株及載體 農(nóng)桿菌C58C1（攜帶pSoup輔助質(zhì)粒）由法國(guó)Thierry Candresse[13]實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。構(gòu)建突變體克隆的載體pGreenII-35S（登錄號(hào)：KX826944）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.3 血清 PLDMV抗血清[14]由本實(shí)驗(yàn)室制備、保存。間接ELISA法檢測(cè)PLDMV抗血清效價(jià)為1：10000。

1.1.4 主要試劑 高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix、普通Taq酶Premix Taq（Taq Version 2.0）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript ?? 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自TaKaRa公司；RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；Gibson Assembly Master Mix購(gòu)自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成及測(cè)序 根據(jù)PLDMV-DF全長(zhǎng)基因組序列、pGreenII-35S載體序列及突變位點(diǎn)，利用Verctor NTI advance II軟件，設(shè)計(jì)Gibson拼接法構(gòu)建PLDMV-DF突變體的引物（表1），引物合成和測(cè)序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2.2 PLDMV-DF突變體的構(gòu)建 本試驗(yàn)采用Gibson拼接法引入突變位點(diǎn)并快速構(gòu)建其突變體侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP-R183/I的方法[12]。具體構(gòu)建步驟如下：以本實(shí)驗(yàn)室保存的在nib/cp之間插有g(shù)fp基因的PLDMV-DF（圖1-A）侵染性克隆質(zhì)粒p35S-PLDMV-GFP為模板，利用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix，分別用引物對(duì)pldmv2121R/I-F、pldmv3R-30T和引物對(duì)pGr35S-pldF、pldmv2121R/I-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的DNA片段a和b，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，膠回收目的片段a和b。通過Gibson Assembly Master Mix 將片段a和b連接，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)C58C1（含pSoup輔助質(zhì)粒），然后進(jìn)行挑取單克隆以及后續(xù)的PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。以提取的陽性克隆質(zhì)粒為模板，利用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix，分別用引物對(duì)pGreenII-F、pldmv6347R 和pldmv6322F、pGreenII-R將PLDMV-DF病毒全長(zhǎng)基因組序列分為兩個(gè)重疊約6 kb的DNA大片段P5和P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收大片段P5和P3后送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，測(cè)序引物見表1，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast分析和利用Verctor NTI advance II軟件進(jìn)行拼接、比對(duì)分析。序列完全正確的R183/I突變體克隆即命名為：p35S-PLDMV-GFP-R183/I（圖1-B）。

1.2.3 PLDMV-DF突變體接種番木瓜的病癥觀察及鑒定 將構(gòu)建的PLDMV-DF突變體p35S-PLDMV-GFP-R183/I和對(duì)照組（陽性對(duì)照CK+為強(qiáng)毒株侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP，陰性對(duì)照CK-為轉(zhuǎn)化空載體pGreenII-35S的農(nóng)桿菌克隆）分別農(nóng)桿菌注射接種生長(zhǎng)至20～30 cm 的非轉(zhuǎn)基因番木瓜植株上，每組接種10株番木瓜苗，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。農(nóng)桿菌注射接種的方法主要參考Youssef等[15]的方法。接種后的番木瓜苗在溫室中（25 ℃，光照12 h）培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況并進(jìn)行拍照。在農(nóng)桿菌注射接種第30天和第60天，將整株苗用長(zhǎng)波長(zhǎng)（365 nm）的紫外（UV）燈（Black Ray B-100 A；Upland，CA，USA）進(jìn)行觀察拍照；在農(nóng)桿菌注射接種第30天，取頂端第2片或第3片葉在熒光顯微鏡下觀察發(fā)光情況，并對(duì)頂端第2片或第3片葉（非接種葉片，葉片長(zhǎng)約1 cm為第1片葉），采用Trizol法提取番木瓜葉片總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，RNA提取和反轉(zhuǎn)錄具體操作參考其說明書。對(duì)cDNA模板用引物對(duì)pldmv1980F、pldmv2894R（表1）進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并對(duì)其RT-PCR產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，從而驗(yàn)證番木瓜植株感染的是否為接種的克隆。

1.2.4 間接ELISA檢測(cè)病毒積累量 參照王振宇[16]的方法。其中酶標(biāo)抗體為全式金辣根過氧化物酶羊抗兔，顯色底物為DAB。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLDMV-DF突變體克隆的構(gòu)建

以質(zhì)粒p35S-PLDMV-GFP為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的片段 a和片段b，大小分別約為8.8、5.3 kb（圖2-A），經(jīng)Gibson拼接后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，經(jīng)初步菌液PCR鑒定，從挑取的12個(gè)單菌落中鑒定出10個(gè)陽性克?。▓D2-B）。然后從中挑取2個(gè)克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取并進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定，結(jié)果都獲得目的大小片段，對(duì)其中一個(gè)克隆的2個(gè)大片段P5和P3進(jìn)行測(cè)序（圖2-C），經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證均正確，除在hc-pro基因的第183位由精氨酸（R）突變?yōu)轭A(yù)期的異亮氨酸（I）之外，PLDMV-DF的全長(zhǎng)基因組序列上無堿基突變。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了hc-pro基因保守基序FRNK的精氨酸（R）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）（R663→I）的突變體克隆p35S-PLDMV-GFP-R183/I（圖1-B）。

2.2 弱毒突變體接種番木瓜的病癥觀察和鑒定

農(nóng)桿菌注射法接種番木瓜后第30天，接種強(qiáng)毒株侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP的陽性對(duì)照組（CK+），番木瓜頂端葉片開始出現(xiàn)輕微的褪綠和皺縮（圖3-B），莖桿上有水漬狀出現(xiàn)，而接種PLDMV-DF突變體克?。╬35S-PLDMV-GFP-R183/I）和陰性對(duì)照組（CK-）的番木瓜均未有明顯癥狀（圖3-B）。在UV燈下觀察時(shí)，陽性對(duì)照組可見綠色熒光，主要表現(xiàn)在頂端嫩葉的葉脈和葉柄上（圖3-A）；而接種PLDMV-DF突變體（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）的番木瓜植株與陰性對(duì)照組一樣，葉片和葉脈都觀察不到綠色熒光（圖3-A）。在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，陽性對(duì)照組的番木瓜葉片和葉脈可見很強(qiáng)的綠色熒光（圖3-C），而接種突變體克?。╬35S-PLDMV-GFP-R183/I）的僅在局部葉片和葉脈上觀察到很弱的綠色熒光（圖3-C），而陰性對(duì)照組的番木瓜葉片觀察不到綠色熒光（圖3-C）。接種PLDMV-DF突變體（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）和陽性對(duì)照組接種的番木瓜植株RT-PCR檢測(cè)時(shí)，都有約915 bp目的條帶（圖4），PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，突變體克?。╬35S-PLDMV-GFP-R183/I）能系統(tǒng)性侵染番木瓜，并能穩(wěn)定的在子代病毒中遺傳。

農(nóng)桿菌注射60 d后，接種強(qiáng)毒株侵染性克隆p35S-PLDMV-GFP的陽性對(duì)照組（CK+），番木瓜嫩葉出現(xiàn)嚴(yán)重畸形，頂端出現(xiàn)停止生長(zhǎng)，莖桿上有嚴(yán)重水漬狀出現(xiàn)（圖5-B～C），而接種PLDMV-DF突變體克?。╬35S-PLDMV-GFP-R183/I）在葉片上仍沒有明顯病癥，但莖桿上有少量水漬狀出現(xiàn)（圖5-B～C），而接種陰性對(duì)照組（CK-）的番木瓜葉片和莖均沒有明顯病癥（圖5-B～C）。在UV燈下觀察時(shí)，陽性對(duì)照組（CK+）的頂端葉片和葉柄上可見很強(qiáng)的綠色熒光（圖5A）；而接種PLDMV-DF突變體（p35S-PLDMV-GFP-R183/I）的番木瓜植株與陰性對(duì)照組一樣，葉片和葉脈都觀察不到綠色熒光（圖5-A）。其中，3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（表2）結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組（CK+）的侵染性高達(dá)90%以上，p35S-PLDMV-GFP-R183/I的侵染性也達(dá)到80%以上。

2.3 弱毒株突變體侵染番木瓜病毒積累量分析

ELISA結(jié)果表明（圖6），p35S-PLDMV-GFP-R183/I接種番木瓜中30 d時(shí)，PLDMV CP積累量遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照組（CK+）。在接種60 d時(shí)，陽性對(duì)照組（CK+）的番木瓜葉片中CP的積累量明顯比接種30 d時(shí)檢測(cè)值高，而p35S-PLDMV-GFP-R183/I的番木瓜葉片中CP積累量與接種60 d檢測(cè)值相比略有一點(diǎn)增長(zhǎng)，但仍遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照組（CK+），且與陰性對(duì)照組（CK-）的檢測(cè)值接近。

2.4 PLDMV-DF致病力相關(guān)位點(diǎn)分析

將5個(gè)PLDMV全長(zhǎng)氨基酸序列與64個(gè)馬鈴薯Y病毒屬病毒的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示：hc-pro基因上的FRNK基序在69個(gè)馬鈴薯Y病毒屬病毒中均非常保守（圖7）。而本實(shí)驗(yàn)中將PLDMV-DF的hc-pro基因上第183位精氨酸（R）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）時(shí)，會(huì)減輕在番木瓜上的病癥，且延遲發(fā)病，可見FRNK保守基序與病毒致病性相關(guān)，當(dāng)精氨酸突變?yōu)楫惲涟彼釙r(shí)會(huì)嚴(yán)重影響其致病力。

3 討論

hc-pro基因是馬鈴薯Y病毒屬病毒中研究最多的一個(gè)多功能基因，主要參與蚜蟲傳播、抑制基因沉默、病毒運(yùn)動(dòng)、病癥表現(xiàn)等功能[7]。研究報(bào)道了hc-pro基因上的保守基序FRNK與致病性、小RNA結(jié)合及癥狀發(fā)生等緊密相關(guān)[9-10， 17-19]。ZYMV的保守基序FR180NK人工突變?yōu)镕I180NK時(shí)，可獲得病癥明顯減輕的臺(tái)灣ZYMV弱毒株GAC和以色列弱毒株AG，且對(duì)ZYMV強(qiáng)毒株均有較好的交叉保護(hù)效果[9-10]。還有研究表明，將馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的hc-pro中的基序FRNK突變?yōu)镕INK后，hc-pro喪失了抑制RNA沉默的活性[16]。同樣在煙草脈帶花葉病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）上證明，F(xiàn)RNK（X）12CDN基序的突變都能影響hc-pro的抑制RNA活性[20]。本實(shí)驗(yàn)室在番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）的弱毒株構(gòu)建中驗(yàn)證了R728是決定PRSV-LM致病性和病癥表現(xiàn)的關(guān)鍵位點(diǎn)[21]。此外，進(jìn)一步研究了保守基序FRNK的功能可能涉及到小RNA途徑，從而影響其致病性和病癥發(fā)生[17-19]。本研究將PLDMV-DF的hc-pro基因上的保守基序FR183NK突變?yōu)镕I183NK，獲得了在番木瓜上病癥顯著減弱的突變體p35S-PLDMV-GFP-R183/I，可作為弱毒株用于后續(xù)交叉保護(hù)防控PLDMV的研究，同時(shí)證實(shí)保守基序FRNK的R位點(diǎn)也是影響PLDMV-DF致病性和癥狀表現(xiàn)的關(guān)鍵位點(diǎn)。

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