宮延斌，秦傳利，石 戈，廖 智

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，海洋生物蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316022）

抗菌肽因其廣譜的抗菌活性和微生物對(duì)其難以產(chǎn)生抗性等優(yōu)勢(shì)而成為當(dāng)前生物活性物質(zhì)研究的重要內(nèi)容。同時(shí)抗菌肽也是當(dāng)前新型生物抗生素研究的先導(dǎo)分子，在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)等方面具有重要的研究意義。海洋生物歷來(lái)是抗菌肽研究的重要領(lǐng)域，其中貽貝（Mytilus）抗菌肽因其抗菌活性強(qiáng)，分子種類豐富而成為海洋生物抗菌肽研究的重要物種。目前已從貽貝中鑒定抗菌肽共計(jì)9個(gè)家族，包括mytilin[1]、myticin[2]、mytimycin[3]、defensin[4-5]、mytimacin[6]、big defencin[6]以及 mytichitin-CB[7]、myticusin[8]以及最近被報(bào)道的 Myticalins[9]。這使得貽貝成為海洋生物中，發(fā)現(xiàn)抗菌肽家族最多的物種之一。對(duì)已被抗菌肽的相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能研究表明，貽貝抗菌肽具有較強(qiáng)的功能多樣性和結(jié)構(gòu)多樣性，具有重要的研究?jī)r(jià)值[10]。

厚殼貽貝Mytilus coruscus具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是我國(guó)東部海域常見(jiàn)的養(yǎng)殖貝類[11]。厚殼貽貝體內(nèi)富含多種抗菌肽分子，在此前的研究中已發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了厚殼貽貝抗菌肽mytilin，myticin，myticusin等。Mytichitin-CB是近年來(lái)于厚殼貽貝血清中鑒定到的一種分子量為6.3 kD的抗菌肽，其序列由55個(gè)氨基酸殘基組成，含三對(duì)二硫鍵。與其他貽貝抗菌肽不同的是，該抗菌肽含幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（chitin-biding domain，CB）。此前的研究表明，mytichitin-CB是厚殼貽貝幾丁質(zhì)酶的C端部分，在體內(nèi)經(jīng)裂解后釋放入血淋巴作為抗菌肽參與厚殼貽貝的免疫防御[7]。這也是首次發(fā)現(xiàn)貽貝幾丁質(zhì)酶存在與魚(yú)類組蛋白樣抗菌肽的體內(nèi)裂解現(xiàn)象[12]?？梢?jiàn)mytichitin-CB具有較為特殊的生理活性以及產(chǎn)生機(jī)制。但是由于天然mytichitin-CB在貽貝體內(nèi)含量極低，因而對(duì)其后續(xù)研究較為困難。為深入研究厚殼貽貝mytichitin-CB的結(jié)構(gòu)與功能，根據(jù)mytichitin-CB的氨基酸序列，采用固相多肽化學(xué)合成 (Solid-phase peptide synthesis，SPPS)手段合成了mytichitin-CB，同時(shí)開(kāi)展了合成mytichitin-CB的氧化復(fù)性和功能研究。上述研究為進(jìn)一步揭示mytichitin-CB的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸、二氯甲烷、二異丙基乙胺、HOBt(1-羥基-苯并-三氮唑)、TBTU(1-氧-3-雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽)、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)等固相化學(xué)合成試劑購(gòu)自上海吉爾公司。NMM(N-甲基嗎啉)、piperidine(哌啶)、Fmoc-Rink-AM-Resin 合成樹(shù)脂、TFA(三氟乙酸)為 Sigma 公司產(chǎn)品。乙腈為美國(guó)TEDIA公司產(chǎn)品。

1.2 mytichitin-CB的固相化學(xué)合成與鑒定

厚殼貽貝mytichitin-CB的氨基酸序列如下：TVKCGMNGKMP-CKHGAFYTDTCDKNVFYRCVWGRPVKKHCGRGLVWNPRGFCDYA；該目標(biāo)序列共55個(gè)氨基酸殘基，含6個(gè)半胱氨酸，在不形成二硫鍵的情況下，其理論分子量6 304.4 Da；采用固相多肽化學(xué)合成策略，在Tetras多肽合成儀(美國(guó)ThuraMed公司)上進(jìn)行多肽化學(xué)合成，基本路線為：將事先以二氯甲烷溶脹好的FMOC-Rink-AM-Resin樹(shù)脂置入反應(yīng)器；之后選取C端第一個(gè)殘基（FMOC-丙氨酸，F(xiàn)MOC-Ala）于二氯甲烷中溶解,再加入二異丙基乙胺混合后加入反應(yīng)器中，吹N2反應(yīng)2 h,將反應(yīng)液過(guò)濾除去，加入甲醇封閉反應(yīng)1 h后，以DMF清洗反應(yīng)器，然后用配制好的去保護(hù)劑去除樹(shù)脂上的FMOC保護(hù)基團(tuán)，時(shí)間20 min，之后用DMF洗滌數(shù)次。稱取C端第二個(gè)氨基酸FMOC-Tyr(tBu)-OH，加入TBTU和二異丙基乙胺為縮合劑，并加入DMF為溶劑，放入反應(yīng)柱中，吹N2反應(yīng)2 h。以去保護(hù)液去除FMOC-Tyr（tBu）-OH的FMOC保護(hù)基團(tuán)，DMF洗滌。重復(fù)上述步驟，直到最后一個(gè)氨基酸殘基（蘇氨酸，Thr）偶聯(lián)反應(yīng)完全。加入K試劑(含82.5%的TFA，5%的苯酚，5%的苯甲硫醚，以及2.5%的巰基乙醇水溶液)，完成對(duì)合成后的多肽進(jìn)行側(cè)鏈去保護(hù)以及從樹(shù)脂上裂解。

合成后的線性多肽粗品采取高效液相色譜進(jìn)行分離純化，色譜柱為C8反相柱（4.6×250 mm,Diamonsil 5 μm），洗脫液分別為A液：含0.1%TFA的純水；B液：含0.1%TFA的乙腈；洗脫梯度為25 min內(nèi)B液比例由10%上升到25%；流速為1.0 mL/min；采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。收集洗脫目標(biāo)峰開(kāi)展質(zhì)譜分析。

采用質(zhì)譜（WatersZQ2000，美國(guó)Waters公司）分析洗脫目標(biāo)峰的精確分子量，質(zhì)譜檢測(cè)條件為：氣動(dòng)輔助電噴霧離子化（ESI）；毛細(xì)管電壓為4.50 kV；檢測(cè)器電壓為1.5 kV；干燥氣流速為1.5 L/min；離子源溫度為250℃；輔助氣溫度為200°C；離子檢測(cè)方式為選擇性離子檢測(cè)；離子極性為正離子。

1.3 mytichitin-CB的氧化復(fù)性

采用谷胱甘肽氧化型（GSSG）和還原型（GSH）按1:10配置混合溶液（其中，GSH濃度為1.5 mmol/L，GSSG濃度為0.15 mmol/L，含0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液及 0.05 mol/L的NaCl溶液，pH值為8.6）對(duì)固相合成后的mytichitin-CB進(jìn)行復(fù)性；復(fù)性溫度為4°C，復(fù)性時(shí)間為24 h，每12 h采用HPLC對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

復(fù)性后的mytichitin-CB蛋白采用C8反相柱進(jìn)行分離純化；氧化復(fù)性后的mytichitin-CB經(jīng)離心和過(guò)濾后上樣反相高效液相色譜；采用安捷倫C8反相柱（5 μm，300 A）；流速為1 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)為280和254 nm；采取線性梯度洗脫，30 min內(nèi)乙腈濃度由15%上升到35%；收集主要洗脫峰，經(jīng)凍干后置于冰箱保存；

1.4 抑菌活性檢測(cè)

采用生長(zhǎng)曲線抑制法測(cè)定合成mytichitin-CB的抑菌活性[7]。測(cè)試用細(xì)菌共14種（表1），事先用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD630達(dá)到0.01；在預(yù)先經(jīng)滅菌處理的96孔板中，每孔加入90 μL菌液。合成且復(fù)性后的mytichitin-CB以滅菌純水溶解，（500 μmol/L），然后倍比稀釋，最低濃度為1.25 μmol/L，以純水作為陰性對(duì)照；將各濃度樣品溶液按10 μL/孔加入96孔板中，將96孔板置于振蕩器上輕柔振蕩促使樣品和菌液混合均勻，之后將96孔板置于恒溫箱，37℃培養(yǎng)10 h。之后采用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD630值，通過(guò)與培養(yǎng)前的吸光值進(jìn)行比較以衡量多肽對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用。對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度 (Minimal inhibitory concentrations，MIC)的范圍值[a]～[b]代表Mytichin-CB的抑菌活性用，其中[a]代表細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)時(shí)，其加入的多肽樣品的最大濃度，而[b]代表細(xì)菌完全被抑制時(shí)，其加入的多肽樣品的的最低濃度。

1.5 幾丁質(zhì)結(jié)合活性檢測(cè)

幾丁質(zhì)結(jié)合活性采用幾丁質(zhì)孵育結(jié)合SDS-PAGE法測(cè)定。將合成mytichitin-CB配置成1 mg/mL濃度（樣品1）；加入適量幾丁質(zhì)粉末，充分震蕩混勻后室溫下孵育1 h，再經(jīng)離心處理（4°C，12 000 g，15 min），收集上清液（樣品2）；沉淀部分加入5%醋酸，震蕩混勻1 h后，離心收集上清（樣品3）。利用SDS-PAGE分別對(duì)樣品1、2、3進(jìn)行電泳分析；分離膠濃度為15%。樣品按1：1加入電泳上樣緩沖液（上海生工公司）；電泳上樣量為20 μL；采用120 v恒壓模式電泳。電泳結(jié)束后以考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行膠染色并觀察。

2 結(jié)果

2.1 mytichitin-CB 的固相化學(xué)合成、鑒定和復(fù)性

Mytichitin-CB經(jīng)故相多肽化學(xué)合成，分別以HPLC和質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果如圖1。合成后的mytichitin-CB在HPLC分離時(shí)呈單一洗脫峰（圖1A箭頭所示），表明純度較好；質(zhì)譜分析結(jié)果表明，合成的mytichitin-CB的精確分子量為6 303 Da（以圖1B中多電荷峰的分子量乘以相應(yīng)的電荷數(shù)再減去相應(yīng)電荷數(shù)），與理論分子量6 304基本吻合，表明合成成功。其缺失的1 Da分子量是由于固相多肽化學(xué)合成導(dǎo)致多肽的C端出現(xiàn)酰胺化（-CONH2），所以相比羧基化C端（-COOH）的多肽，分子量降低1 Da。

合成mytichitin-CB經(jīng)氧化復(fù)性，通過(guò)HPLC檢測(cè)復(fù)性過(guò)程中分子變化并進(jìn)行純化，結(jié)果如圖2A，隨著復(fù)性時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)性后的mytichitin-CB相較于未復(fù)性的多肽，其空間結(jié)構(gòu)的正確折疊會(huì)導(dǎo)致疏水性氨基酸殘基的包埋，因而其疏水性下降，導(dǎo)致在反相色譜中的洗脫時(shí)間有縮短趨勢(shì)，從0 h的16.87 min提前到復(fù)性24 h后的14.96 min。分別收集復(fù)性前以及復(fù)性24 h后的目標(biāo)峰，開(kāi)展質(zhì)譜分析。結(jié)果見(jiàn)圖2B[l3]。由圖2B可見(jiàn)，復(fù)性后，合成mytichitin-CB的分子量由6 303減少至6 297 Da，減少的6 Da來(lái)自于序列中6個(gè)半胱氨酸形成3對(duì)二硫鍵，因此減少了6個(gè)H所致。上述結(jié)果表明mytichitin-CB復(fù)性成功，可開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 合成mytichitin-CB的HPLC分離（A）和質(zhì)譜鑒定圖（B）。箭頭所示為目標(biāo)洗脫峰。Fig.1 Purification of synthesized mytichitin-CB by HPLC(A)and the mass spectrum of the fraction collected from HPLC elution(denoted by an arrow in Fig.1A)

圖2 氧化復(fù)性過(guò)程中HPLC監(jiān)測(cè)圖（A）及氧化復(fù)性前后質(zhì)譜檢測(cè)圖（B）Fig.2 Chromatograms in oxidative refolding process of the synthesized mytichitin-CB(A)and mass spectrums of synthesized mytichitin-CB before and after oxidation(B)

2.2 合成mytichitin-CB 的抑菌活性

采用生長(zhǎng)曲線抑制法測(cè)試合成mytichitin-CB的抑菌活性。分別測(cè)試了14種菌，合成的mytichitin-CB對(duì)上述菌種的抑制活性見(jiàn)表1，mytichitin-CB對(duì)所測(cè)試的各菌種均有明顯的抑制活性，其中，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制活性相對(duì)較強(qiáng)，平均抑制濃度約為20 μmol/L；其次對(duì)真菌也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，其平均抑制濃度約為11 μmol/L；而合成的mytichitin-CB對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制活性則相對(duì)較弱，其平均抑制濃度約為 60 μmol/L。

表1 合成mytichitin-CB的抑菌活性Tab.1 The antimicrobial activities of synthesized mytichitin-CB

對(duì)合成mytichitin-CB開(kāi)展熱穩(wěn)定性檢測(cè)。將合成mytichitin-CB溶于純水（濃度為50 μmol/L）后，經(jīng)不同溫度孵育30 min，采用滕黃疊球菌為指示菌，檢測(cè)不同溫度處理后的合成mytichitin-CB對(duì)滕黃疊球菌培養(yǎng)皿的抑菌圈，以純水作為對(duì)照，結(jié)果如圖3，合成mytichitin-CB具有較好的熱穩(wěn)定性，60°C孵育30 min后，其對(duì)滕黃疊球菌的抑菌活性未見(jiàn)明顯下降。

2.3 合成mytichitin-CB的幾丁質(zhì)結(jié)合活性

采用幾丁質(zhì)孵育結(jié)合SDS-PAGE法檢測(cè)合成mytichitin-CB的幾丁質(zhì)結(jié)合活性，結(jié)果如圖4，mytichitin-CB與幾丁質(zhì)具有明顯的結(jié)合活性，在與幾丁質(zhì)孵育1小時(shí)并離心后，上清液經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)，無(wú)目標(biāo)條帶（圖4泳道2）。該結(jié)合活性可被5%醋酸解除（圖4泳道3），表明mytichitin-CB與幾丁質(zhì)的結(jié)合屬于可逆性結(jié)合。

圖3 合成mytichitin-CB的經(jīng)不同溫度處理后的抑菌活性檢測(cè)圖Fig.3 The antimicrobial activity of synthesized mytichitin-CB after various heat processes

圖4 SDS-PAGE檢測(cè)合成mytichitin-CB的幾丁質(zhì)結(jié)合活性。Fig.4 The chitin-binding function of mytichitin-CB tested by SDS-PAGE

3 討論

含幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽此前在無(wú)脊椎動(dòng)物[13]和植物中均有報(bào)道[14]。最早發(fā)現(xiàn)具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽為來(lái)自馬蹄蟹Tachypleus tridentatus血細(xì)胞的Tachycitin[15]。Tachycitin由73個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量在8 kDa，其序列中含10個(gè)半胱氨酸并形成5對(duì)二硫鍵；Tachycitin的序列中含有典型的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域且表現(xiàn)出明顯的幾丁質(zhì)結(jié)合活性[15]；此外，從南美白對(duì)蝦Penaeus vannamei中分離到的抗菌肽penaeidins家族（47～63個(gè)氨

基酸組成，含3對(duì)二硫鍵）也是一種代表性的具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子，既具有抗菌活性也具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性[15]。上述抗菌肽分子同時(shí)具有較強(qiáng)的抗真菌活性，其分子機(jī)制推測(cè)與真菌細(xì)胞壁中富含的幾丁質(zhì)有關(guān)[17]；同時(shí)，上述甲殼類抗菌肽的幾丁質(zhì)結(jié)合活性還與甲殼類動(dòng)物體表的損傷修復(fù)有關(guān)[15]。這表明含幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽是一種多功能分子，對(duì)于抗菌肽的分子進(jìn)化以及開(kāi)發(fā)新型生物抗生素具有重要研究?jī)r(jià)值。

Mytichitin-CB是第一種發(fā)現(xiàn)自貽貝的含幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子。在序列上，mytichitin-CB與Tachycitin、penaeidins等分子差異較大；但在空間結(jié)構(gòu)上，mytichitin-CB與Tachycitin等均采取了以beta-折疊為主的二級(jí)結(jié)構(gòu)[7,18]。由于mytichitin-CB分子在貽貝血清中的含量極低，為此采取了固相多肽化學(xué)合成手段，人工合成了mytichitin-CB分子。目前針對(duì)多肽的固相化學(xué)合成主要有BOC法和FMOC法，其中BOC法對(duì)于短肽合成效果較好，但對(duì)于序列較長(zhǎng)的多肽則效率較低；而FMOC法則反應(yīng)條件溫和，適合較長(zhǎng)序列的多肽合成。由于mytichitin-CB分子序列較長(zhǎng)，因此本研究采取了FMOC策略，所合成的mytichitin-CB經(jīng)HPLC法檢測(cè)，其純度超過(guò)90%。此外，mytichitin-CB含有3對(duì)二硫鍵，因此在合成后需要經(jīng)過(guò)氧化復(fù)性，才能得到真正有活性的多肽分子。氧化復(fù)性歷來(lái)是抗菌肽合成的難點(diǎn)領(lǐng)域。從目前的結(jié)果來(lái)看，富含二硫鍵的抗菌肽分子在合成后，其復(fù)性率通常都在15%左右，且尚無(wú)統(tǒng)一的，高效的氧化復(fù)性策略[18]。多肽二硫鍵的正確配對(duì)涉及一個(gè)非常復(fù)雜的氧化復(fù)性過(guò)程，GSSG/GSH所形成的巰基氧化還原對(duì)是目前用于多肽氧化復(fù)性的常用手段；同時(shí)，二硫鍵的形成涉及巰基/二硫鍵的交換反應(yīng)，而半胱氨酸巰基的解離值（pKa）為8.6左右，因此在本研究中，我們采取了GSSG/GSH為1：10的比例，pH值設(shè)定為8.6，同時(shí)將復(fù)性時(shí)間設(shè)置為24 h，在此情況成功完成對(duì)合成的mytichitin-CB的氧化復(fù)性，通過(guò)HPLC結(jié)合質(zhì)譜法檢測(cè)復(fù)性效率；同時(shí)，根據(jù)HPLC洗脫峰峰面積經(jīng)歸一化計(jì)算復(fù)性產(chǎn)率，最終計(jì)算出合成mytichitin-CB的復(fù)性率約為20%。

在前期研究中，天然mytichitin-CB分子對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌和真菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用[7]。對(duì)合成及復(fù)性成功后mytichitin-CB分子的研究表明，該多肽同樣具有明顯的抑菌活性，且與天然mytichitin分子相比[7]，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌和真菌的抑制作用未發(fā)生明顯變化，仍表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用則相對(duì)較弱；上述結(jié)果表明，合成且復(fù)性成功的mytichitin-CB與天然的mytichitin-CB分子具有相同的結(jié)構(gòu)與功能。此外，本研究發(fā)現(xiàn)合成mytichitin-CB具有較好的熱穩(wěn)定性，在60°C孵育30 min后，其抑菌活性未見(jiàn)明顯下降，推測(cè)由于mytichitin-CB存在3對(duì)二硫鍵而使得其分子結(jié)構(gòu)致密，因而具有較好的熱穩(wěn)定性，這表明mytichitin-CB具有較好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究?jī)r(jià)值。此外，mytichitin-CB分子序列中含有典型的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域[7]，在本研究中，通過(guò)SDS-PAGE方法驗(yàn)證了mytichitin-CB與幾丁質(zhì)之間存在可逆的結(jié)合作用。這種結(jié)合作用也被認(rèn)為是含幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽對(duì)真菌產(chǎn)生抑制作用的原因[19-20]。但是幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ诳咕囊种萍?xì)菌的作用機(jī)制目前尚不清楚。mytichitin-CB的成功合成及復(fù)性，為后續(xù)開(kāi)展mytichitin-CB的抗菌分子機(jī)理以及mytichitin-CB的蛋白質(zhì)工程研究奠定了基礎(chǔ)。

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