產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的無色桿菌ZWW8的發(fā)酵產(chǎn)酶及酶學(xué)性質(zhì)研究

張瑤心 王亮節(jié) 鄭文 徐漢琴 鄭戀 鐘靜

（湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點實驗室，武漢 430205）

幾丁質(zhì)（Chitin）是由N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4糖苷鍵連接而成的多聚物，是蝦蟹等甲殼動物的殼、昆蟲的外骨骼和許多真菌的細(xì)胞壁的重要組成成分，在自然界中的含量僅次于纖維素［1］。植物、動物及微生物都能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶切割β-1，4糖苷鍵來降解幾丁質(zhì)，以實現(xiàn)各自的生理功能。根據(jù)作用方式的差異，幾丁質(zhì)酶可以被分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶隨機(jī)地降解幾丁質(zhì)鏈內(nèi)部的β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生各種不同大小的低聚糖。而外切幾丁質(zhì)酶從幾丁質(zhì)的非還原端逐個切割，釋放幾丁二糖［2］。許多微生物會產(chǎn)生幾個不同切割方式的幾丁質(zhì)酶，協(xié)同作用完成對幾丁質(zhì)的降解。

近年來，幾丁質(zhì)酶因在制備幾丁寡糖、處理海洋廢棄物以及農(nóng)業(yè)生物防治等方面具有大的應(yīng)用潛力而備受關(guān)注［3-5］。幾丁質(zhì)酶通過降解昆蟲的外骨骼及其圍食膜中的幾丁質(zhì)，使其喪失生命活動能力，從而殺死害蟲；幾丁質(zhì)酶通過降解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，破壞真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而抑制真菌的生長。此外，將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胫参锛?xì)胞中以構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，能抵抗真菌和害蟲的侵害［6-9］。利用微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶處理蝦蟹殼廢棄物，不僅可以大大緩解環(huán)境污染的壓力，還可以變廢為寶、創(chuàng)造幾丁寡糖等高附加值產(chǎn)品，作為藥物輸送載體、抗氧化劑和食品保存中的抗菌材料，可用于止血、傷口愈合、癌癥預(yù)防和治療等方面［10］。但目前的研究還存在幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌發(fā)酵產(chǎn)酶水平低、產(chǎn)酶周期長等問題，限制了其應(yīng)用。此外，工業(yè)生產(chǎn)時常會涉及如高溫、強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性和低水活度環(huán)境等不利條件，常規(guī)酶容易聚集沉淀并喪失活性及穩(wěn)定性，需要開發(fā)高效、穩(wěn)定的新型幾丁質(zhì)酶。

無色桿菌屬于腸桿菌科Enterobacteriaceae，能通過寄生在線蟲腸道內(nèi)，侵入各種昆蟲體內(nèi)，對線蟲和各種鱗翅目昆蟲有殺傷作用。近些年來，已經(jīng)有一些關(guān)于無色桿菌屬的細(xì)菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的報道。1976年，Chigale?chik等［11］分離得到一株在幾丁質(zhì)中生長并產(chǎn)生胞外幾丁質(zhì)酶的液化無色桿菌（Achromobacter liquefaciens）。1993 年，Takashi等［12］分離得到了一株能夠降解幾丁質(zhì)的無色桿菌，該菌株具有抗菌、抗線蟲及活化植物細(xì)胞的能力。2015年，Bholay等［13］從印度漁業(yè)固體廢物中分離得到的反硝化無色桿菌Achromobacter denitrificans，在以幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生外切幾丁質(zhì)酶。本實驗室從中國湖北省武漢市的蝦殼堆積處的土壤中篩選得到一株能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌ZWW8，并發(fā)現(xiàn)其幾丁質(zhì)酶能在高鹽條件下降解幾丁質(zhì)，通過16S rDNA鑒定其屬于Achromobacter屬。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于Achromobacter屬細(xì)菌產(chǎn)耐鹽幾丁質(zhì)酶的研究報道。本文系統(tǒng)研究了產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的無色桿菌的鑒定，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶發(fā)酵條件優(yōu)化及幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)檢測，旨在發(fā)掘新的產(chǎn)耐鹽幾丁質(zhì)酶的菌株，提高幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量和酶活力，為篩選適用于工業(yè)生產(chǎn)的高效穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 幾丁質(zhì)粉末購自Sigma公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xoid公司；水溶性殼聚糖購自山東奧康生物科技有限公司；殼聚糖粉末購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；N-乙酰-D-氨基葡萄糖購自阿拉丁公司；Pfu DNA聚合酶和DNA marker購自全式金生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；低分子量蛋白質(zhì) Marker購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、NaCl、NH4Cl、HCl、NaOH、瓊脂粉、乙酸、生理鹽水、3，5-二硝基水楊酸、尿素、葡萄糖、NH4NO3、NaNO3、（NH4）2SO4等化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

恒溫金屬浴（TU-10）：上海一恒科技有限公司；氣浴恒溫振蕩器（THZ-92B）：上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5200PC）：上海元析儀器有限公司；梯度熱循環(huán)PCR儀（C1000 Touch）：Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Chemi Doc XRS+）：Bio-Rad公司；連續(xù)光譜光吸收酶標(biāo)儀（Spectra Max Plus 384）：Molecular Devices公司

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液 種子培養(yǎng)基：NaCl 10 g，酵母粉 5 g，蛋白胨 10 g，蒸餾水1 L，pH 自然。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.53 g，KH2PO40.3 g，K2HPO40.7 g，酵母粉 1 g，粉末幾丁質(zhì) 5 g，蒸餾水1 L，pH自然。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.53 g，KH2PO40.3 g，K2HPO40.7 g，酵母粉 1 g，膠體幾丁質(zhì) 5 g，NH4Cl 3 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

膠體幾丁質(zhì)：10 g幾丁質(zhì)粉末溶解0.4 L 濃鹽酸中，離心后將上清加入4 L去離子水，靜置過夜后離心棄去上清，將沉淀用去離子水重懸，并加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，并去離子水洗滌3次。取4 mL膠體幾丁質(zhì)離心棄上清，將沉淀在60℃烘箱烘干至恒重，計算膠體幾丁質(zhì)濃度。

膠體殼聚糖：10 g殼聚糖粉末溶解于0.4 L 1%乙酸中，將上清加入4 L去離子水，靜置過夜后離心棄去上清，將沉淀用去離子水洗滌3次。取4 mL膠體殼聚糖離心棄上清，將沉淀在60℃烘箱烘干至恒重，計算膠體殼聚糖濃度。

幾丁質(zhì)親和層析純化幾丁質(zhì)酶所用溶液：洗滌緩沖液（g/L）：NaCl 150，KH2PO40.3，K2HPO40.7，pH 7.0；洗脫緩沖液（g/L）：Urea 480，KH2PO40.3，K2HPO40.7，pH 7.0；透析緩沖液（g/L）：NaCl 10，KH2PO40.3，K2HPO40.7，pH 7.0。

1.1.3 實驗樣品 本課題組從湖北某高校校園中蝦殼堆積處的土壤中取樣，進(jìn)行富集培養(yǎng)之后，采用透明圈法，以膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源，篩選出產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性高的菌株ZWW8。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選與分子生物學(xué)鑒定 利用原核生物 16S rDNA 通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），以ZWW8的菌液為模板進(jìn)行PCR，電泳后用膠回收試劑盒純化DNA片段，并送樣測序，測序結(jié)果包含V1-V8的高變區(qū)和部分V9區(qū)，可用來進(jìn)行物種初步鑒定及比較親緣關(guān)系［14-15］。在NCBI網(wǎng)站對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST搜索，選取與其相似性較高的16S rDNA序列進(jìn)行比對，并用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 幾丁質(zhì)酶活性的測定方法 取200 μL酶液加入200 μL 的1%（W/V）膠體幾丁質(zhì)，混合后置于45℃反應(yīng)保溫1 h，離心，取上清300 μL加入300 μL DNS混勻，100℃加熱20 min。等樣品冷卻后，12 000 r/min離心10 min，取上清測定其在540 nm處的吸光值，對照組所用為經(jīng)過100℃滅活后的酶液。實驗組和對照組的差值反映了幾丁質(zhì)酶的活性。根據(jù)N-乙酰葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算還原糖含量。酶活力單位定義：在合適條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol的N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)基中的碳源、氮源、溫度、初始pH 和產(chǎn)酶時間進(jìn)行優(yōu)化。在初始培養(yǎng)基中分別加入0.5%（W/V）的粉末幾丁質(zhì)、膠體幾丁質(zhì)、水溶性殼聚糖、粉末殼聚糖、葡萄糖或N-乙酰葡萄糖胺作為碳源，確定最佳碳源，并檢測碳源添加量對產(chǎn)酶的影響。在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別加入0.3%（W/V）的（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3、尿素及蛋白胨作為氮源，檢測發(fā)酵上清的幾丁質(zhì)酶活性，確定最佳氮源。在碳源和氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，依次考查將發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值（5.0-9.0），發(fā)酵溫度（28-45℃）和發(fā)酵時間對胞外上清幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響，確定最優(yōu)的發(fā)酵產(chǎn)酶條件。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.4.1 溫度對幾丁質(zhì)酶活力的影響 在pH 7.0，1%NaCl條件下，以膠體幾丁質(zhì)為底物，檢測粗酶液在不同溫度條件下的活性，以最高酶活為100%，計算其相對酶活。

1.2.4.2 pH 對幾丁質(zhì)酶活力的影響 在1% NaCl，45℃條件下，檢測粗酶液在不同pH條件下的活性，以最高酶活為100%，計算其相對酶活。

1.2.4.3 NaCl濃度對幾丁質(zhì)酶活性的影響 在pH 7.0，45℃條件下，檢測粗酶液在不同NaCl濃度中的活性，以最高酶活為100%，計算其相對酶活。

1.2.4.4 金屬離子對幾丁質(zhì)酶活性的影響 向粗酶液中加入10 mmol/L EDTA，并透析除去EDTA，再向酶液中加入5 mmol/L不同金屬離子，檢測其活性，以不加入金屬離子的酶液的酶活為100%，計算幾丁質(zhì)酶在不同金屬離子存在時的相對酶活。

1.2.4.6 NaCl濃度對穩(wěn)定性的影響 向粗酶液中加入NaCl配制成不同NaCl濃度的酶液，將各組酶液于55℃保溫30 min，再檢測酶活。分別以未經(jīng)過熱處理的各NaCl濃度的酶液的活力定義為100%，計算各NaCl濃度中幾丁質(zhì)酶的殘余活性百分比。

1.2.4.7 NaCl濃度對幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合能力的影響 向粗酶液中加入NaCl配制成不同NaCl濃度的酶液，取1 mL 酶液加入0.2 mL相同NaCl濃度的1%（W/V）膠體幾丁質(zhì)，混合后靜置30 min，然后離心檢測上清的幾丁質(zhì)酶活性，分別以與幾丁質(zhì)結(jié)合前的各NaCl濃度酶液的活性定義為100%，計算幾丁質(zhì)酶在不同NaCl濃度中與幾丁質(zhì)的結(jié)合率。

1.2.5 幾丁質(zhì)酶的純化及SDS-PAGE 取20 mL 含有15% NaCl的幾丁質(zhì)粗酶液，加入幾丁質(zhì)親和層析柱，收集流出液并反復(fù)上樣3次，然后依次加入10 mL 洗滌液和5 mL洗脫液，收集流出液。將洗脫液透析復(fù)性，并檢測幾丁質(zhì)酶活性。將粗酶液、上樣流出液、洗滌液和洗脫液各0.4 mL進(jìn)行TCA沉淀制樣并進(jìn)行SDS-PAGE。SDS-PAGE所用分離膠濃度為12.5%，縮膠濃度為4.5%，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行分析，試驗中各發(fā)酵條件的優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)檢測均為3 次平行實驗，結(jié)果以3次實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式展現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選和鑒定

在NCBI網(wǎng)站對ZWW8菌株的16S rDNA測序結(jié)果進(jìn)行BLAST搜索和序列比對，發(fā)現(xiàn)其與Achromobacter屬菌株的16S rDNA序列相似性達(dá)到99.9%以上。圖1 表明ZWW8菌株為Achromobacter屬，并與Achromobacter mucicolens的親緣關(guān)系較近。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的ZWW8菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 1 Phylogenetic tree of strain ZWW8 based on 16S rDNA sequences

2.2 ZWW8菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶條件的優(yōu)化

以0.5%的粉末幾丁質(zhì)為唯一碳源，初始產(chǎn)酶量為4.2 U/L。

以盾構(gòu)隧道底部無溶洞的情況為例，通過計算可得到管片的極限受拉疲勞次數(shù)為1.358×107次，極限受壓疲勞次數(shù)為3.147×1014次，兩者之間相差7個數(shù)量級，說明管片的疲勞壽命是由極限受拉疲勞次數(shù)決定的。

2.2.1 碳源對ZWW8菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 將ZWW8菌株分別在以葡萄糖、膠體幾丁質(zhì)、粉末幾丁質(zhì)、粉末殼聚糖、水溶性殼聚糖和N-乙酰葡萄糖胺為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測發(fā)酵上清中的幾丁質(zhì)酶活性。如表1所示，以膠體幾丁質(zhì)為碳源時，發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶量最高，能達(dá)到20.0 U/L；粉末幾丁質(zhì)次之，發(fā)酵產(chǎn)酶量達(dá)到4.2 U/L。當(dāng)以膠體殼聚糖、葡萄糖、水溶性殼聚糖和N-乙酰葡萄糖胺為碳源時，ZWW8菌株均不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

表1 不同碳源對ZWW8菌株發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響Table 1 Effect of different carbon sources on chitinase production by Achromobacter sp. ZWW8

2.2.2 氮源對ZWW8產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將ZWW8菌株分別在以（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4Cl、NaNO3尿素和蛋白胨為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測上清中幾丁質(zhì)酶活性。如表2 所示，NH4NO3、NH4Cl、（NH4）2SO4和蛋白胨作為氮源時幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量較高，尿素和NaNO3作為氮源時幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量較低。以NH4Cl作為氮源時，發(fā)酵產(chǎn)酶量最高，可達(dá)到20.7 U/L。

表2 不同氮源對ZWW8菌株發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響Table2 Effect of different nitrogen sources on chitinase production by Achromobacter sp. ZWW8

2.2.3 初始pH對ZWW8菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 在碳源和氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將ZWW8菌株分別在初始pH值為5-9的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測其發(fā)酵上清的活性。圖2表明，ZWW8菌株在pH 5-9均能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，且在pH 7時產(chǎn)酶量最高，能達(dá)到32 U/L。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對ZWW8菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響Fig.2 Effect of initial medium pH on chitinase production by Achromobacter sp. ZWW8

2.2.4 溫度對ZWW8產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 將ZWW8菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中分別在28-45℃培養(yǎng)，檢測上清中幾丁質(zhì)酶活性。如圖3所示，ZWW8菌株在不同溫度的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量有顯著差距，28℃時不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，而37℃產(chǎn)酶量最高，可以達(dá)到33.9 U/L。

圖3 溫度對ZWW8菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響Fig.3 Effect of temperatures on chitinase production by Achromobacter sp. ZWW8

2.2.5 發(fā)酵時間對ZWW8菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)溫度優(yōu)化的基礎(chǔ)上，檢測ZWW8菌株在不同時間的產(chǎn)酶量。如圖4所示，ZWW8菌株培養(yǎng)1 d后就開始大量分泌幾丁質(zhì)酶，并在第2天產(chǎn)酶量最大，達(dá)到32 U/L。此后幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量開始下降，第5天時幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量僅為3 U/L。

圖4 發(fā)酵時間對ZWW8菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響Fig.4 Effect of fermentation time on chitinase production by strain ZWW8

2.3 ZWW8幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)特性

2.3.1 溫度對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響 檢測ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶液在10-65℃條件下的活性，結(jié)果如圖5。幾丁質(zhì)酶在50℃活性最高，且在65℃時活性維持最大活性的50%，在10℃能維持最高活性的25%左右。

圖5 溫度對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on chitinase activity by strain ZWW8

2.3.2 pH對ZWW8幾丁質(zhì)酶活性的影響 檢測ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶在pH 3-9條件下的活性。如圖6所示，隨著pH值上升，酶的活性呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，pH 5.5時酶的活性達(dá)到最高，并在pH 5-7條件下具有較高的活性。

圖6 pH對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.6 Effect of pH on chitinase activity by strain ZWW8

圖7 NaCl濃度對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.7 Effect of NaCl concentration on chitinase activity by strain ZWW8

2.3.3 NaCl濃度對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響 檢測ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶在1%-25% NaCl條件下的活性。如圖7所示，隨著NaCl濃度上升，活性下降。NaCl濃度為1%時幾丁質(zhì)酶的活性最高，而當(dāng)NaCl濃度為25%時，仍然能保持最大活性的64%。

2.3.4 金屬離子對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響 檢測 5 mmol/L 的 Hg2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Ag+、Cu2+和Ni2+等金屬離子對ZWW8幾丁質(zhì)酶活性的影響，如表3所示，Cu2+和Zn2+對酶活有抑制作用，Hg2+可導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶完全失活，Ca2+和Ni2+有一定的促進(jìn)作用。

2.3.5 溫度對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶熱穩(wěn)定的影響 檢測ZWW菌株幾丁質(zhì)酶液分別在40-60℃保溫后的殘余活性，如圖8所示，ZWW菌株的幾丁質(zhì)酶在40℃穩(wěn)定性較好，經(jīng)過1 h保溫活性沒有明顯變化。隨著溫度升高，幾丁質(zhì)酶的穩(wěn)定性逐漸下降，60℃保溫20 min后殘余活性僅有10%。

表3 金屬離子對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響Table 3 Effect of metal ions on chitinase activity by strain ZWW8

圖8 ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶在不同溫度熱處理后的殘余活性Fig.8 Effect of temperature on residual activity of chitinase by strain ZWW8

2.3.6 NaCl濃度對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶熱穩(wěn)定的影響 將1%-20% NaCl ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶液于55℃保溫30 min，檢測其殘余活性。如圖9所示，隨著NaCl濃度提高，幾丁質(zhì)酶熱穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)。NaCl濃度為20%時，幾丁質(zhì)酶在55℃保溫30 min后還能維持近70%的活性。

圖9 幾丁質(zhì)酶在不同NaCl濃度熱處理后的殘余活性Fig.9 Effect of NaCl concentration on residual activity of chitinase

2.3.7 NaCl濃度對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合能力的影響 檢測ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶在1%-20% NaCl條件下對幾丁質(zhì)的結(jié)合能力，圖10表明隨著NaCl濃度增加，幾丁質(zhì)酶與膠體幾丁質(zhì)的結(jié)合率明顯提高。

圖10 NaCl濃度對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)結(jié)合能力的影響Fig.10 Effect of NaCl concentration on chitin binding ability of chitinase by strain ZWW8

2.3.8 ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶的純化及SDS-PAGE檢測 為了對ZWW8菌株的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行初步純化，我們利用其幾丁質(zhì)酶能特異性結(jié)合幾丁質(zhì)這一特點，通過幾丁質(zhì)親和層析柱對含有15% NaCl的粗酶液進(jìn)行分離純化。如圖11所示，ZWW8菌株的粗酶液有5條主帶可與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合。對各組分進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活性檢測結(jié)果表明，上樣流出液和洗滌液均無活性，僅有洗脫液透析復(fù)性后具有幾丁質(zhì)酶活性。

3 討論

我國蝦蟹等水產(chǎn)品資源十分豐富，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)價值，但也因此產(chǎn)生大量的廢棄物，造成了環(huán)境的污染和資源的巨大浪費。幾丁質(zhì)作為蝦殼蟹殼的主要成分，可通過物理、化學(xué)處理和酶降解成幾丁寡糖，具有抗微生物、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)傷口愈合和組織再生、控制血壓和降低膽固醇等各項生物活性［16］，可作為殺蟲殺菌劑、免疫增強(qiáng)劑、藥物載體和食品添加劑等進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用［17］。研究表明，利用幾丁質(zhì)酶水解可得到所需長度和脫乙酰度的幾丁寡糖，而且反應(yīng)條件溫和、專一性高、對環(huán)境污染小，是獲得幾丁寡糖最環(huán)保且低能耗的方法［18］。然而工業(yè)生產(chǎn)時常會涉及例如高溫、強(qiáng)酸性、強(qiáng)堿性和低水活度環(huán)境等不利條件，目前所使用的酶在高鹽、低溫和有機(jī)溶劑等低水活度環(huán)境中容易聚集沉淀并喪失活性及穩(wěn)定性，因此開發(fā)適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，耐受各種不利條件，在低水活度環(huán)境中具有活性和穩(wěn)定性的幾丁質(zhì)酶，具有重大經(jīng)濟(jì)價值與理論價值［19-20］。

圖11 幾丁質(zhì)親和層析純化ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶的SDSPAGE檢測圖Fig.11 SDS-PAGE analysis of strain ZWW8 chitinase purified by chitin affinity chromatography

本課題組從湖北省武漢地區(qū)的土壤中篩選得到一株能產(chǎn)生耐鹽幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌ZWW8，經(jīng)鑒定其屬于無色桿菌屬，目前國內(nèi)外關(guān)于無色桿菌屬發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的研究非常少，在無色桿菌屬所在的產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae），也僅發(fā)現(xiàn)氧化木糖產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes xylosoxydans）可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶［21-23］，而該菌種現(xiàn)在也已經(jīng)被鑒定為氧化木糖無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）。我們通過單因素試驗優(yōu)化了ZWW8菌株在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)胞外幾丁質(zhì)酶的的培養(yǎng)條件。不同碳源對該菌株分泌胞外幾丁質(zhì)酶的影響較大，以膠體幾丁質(zhì)為碳源時，發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶量最高，粉末幾丁質(zhì)次之。這可能是因為膠體幾丁質(zhì)表面積較大，容易被ZWW8菌株本底表達(dá)的少量幾丁質(zhì)酶降解產(chǎn)生可溶的幾丁寡糖，進(jìn)一步誘導(dǎo)該菌株大量表達(dá)幾丁質(zhì)酶。當(dāng)以膠體殼聚糖、葡萄糖、水溶性殼聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖為碳源時，ZWW8菌株均不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，這與付星所報道的巴倫葛茲類芽孢桿菌（Paenibacillus barengoltzii CAU904）較相似［24］。說明大部分細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶主要為誘導(dǎo)酶，幾丁質(zhì)及其降解產(chǎn)物能誘導(dǎo)細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的表達(dá)。氮源對ZWW8菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶也有明顯影響，銨鹽和蛋白胨作為氮源時幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量較高，尿素和硝酸鹽作為氮源時幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量較低。這與疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）較相似［25］，1.4 g/L 硫酸銨和 0.1 g/L-0.5 g/L尿素能使該菌株幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量提高4倍。此外，可能因為缺乏其生長所需維生素等的生長因子，ZWW8菌株在合成培養(yǎng)基中生長非常緩慢。因此，在對ZWW8菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化過程中，各發(fā)酵培養(yǎng)基中均額外添加了3 g/L的酵母粉以提供生長因子，也補(bǔ)充了有機(jī)氮源。Vaidya［21］也發(fā)現(xiàn)添加少量酵母粉或蛋白胨等有機(jī)氮源能顯著提高A. xylosoxydans幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)量。

pH對產(chǎn)酶的影響實驗表明，無色桿菌ZWW8在比較廣的pH范圍（5-9）均能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，在pH 7時產(chǎn)酶量最高，當(dāng)pH＞7時產(chǎn)酶量明顯下降。大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最適pH 在中性或者略偏酸性。之前報道的液化無色桿菌A. liquefaciens在pH 6.5時幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量最高［11］。發(fā)酵溫度對胞外幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量也有重要影響，大部分細(xì)菌的最適產(chǎn)酶溫度在30-37℃，如唐德鏈霉菌（Streptomyces tendae）在37℃時幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量最高［26］。ZWW8菌株在28℃幾乎不分泌胞外幾丁質(zhì)酶。隨著培養(yǎng)溫度升高，幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量逐漸增加，37℃時達(dá)到最高，這與A.liquefaciens發(fā)酵產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的最適溫度40℃結(jié)果比較相似［11］。當(dāng)溫度進(jìn)一步上升則胞外幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量開始下降，這可能是由于高溫條件下幾丁質(zhì)酶表達(dá)量和穩(wěn)定性均有所下降。通過檢測發(fā)酵時間對產(chǎn)酶量的影響，發(fā)現(xiàn)ZWW8菌株培養(yǎng)1 d后就開始大量分泌幾丁質(zhì)酶，在第2天達(dá)到峰值，隨后產(chǎn)酶量開始明顯下降。這與在第3天幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量最高的A.xylosoxydans相比［21］，無色桿菌ZWW8的產(chǎn)酶周期較短，更有利于降低生產(chǎn)成本。ZWW8菌株在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃發(fā)酵2 d，胞外上清的酶活力可達(dá)到33.9 U/L，比優(yōu)化前（4.2 U/L）提高了約8倍。不同研究中對于酶活力單位的定義有所差別，如果將酶活力單位（U）統(tǒng)一為每分鐘產(chǎn)生1 μmol的N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量，A. xylosoxydans經(jīng)過產(chǎn)酶條件優(yōu)化后，幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量可達(dá)到483 U/L［22］。因此Achromobacter sp. ZWW8的產(chǎn)酶量處于較低水平，發(fā)酵條件還有待進(jìn)一步優(yōu)化。

通過對ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，我們發(fā)現(xiàn)溫度對幾丁質(zhì)酶活性有顯著影響，無色桿菌ZWW8幾丁質(zhì)酶在較廣的溫度范圍（10-65℃）具有水解活性，最適反應(yīng)溫度為50℃。A. denitrificans幾丁質(zhì)酶的最佳反應(yīng)溫度為35℃［13］，與之相比，無色桿菌ZWW8幾丁質(zhì)酶不僅低溫活性較強(qiáng)，還具有良好的耐熱性。pH也對幾丁質(zhì)酶活性有較大影響，ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶在pH 5-7范圍內(nèi)均有較高的活性，最適反應(yīng)pH為 5.5，為酸性幾丁質(zhì)酶，而A. denitrificans幾丁質(zhì)酶的最佳反應(yīng)pH為7.0［13］。在金屬離子對ZWW8幾丁質(zhì)酶活性的影響中，Ca2+和Ni2+對酶活有一定促進(jìn)作用，Hg2+能完全抑制酶活。之前報道的A. denitrificans幾丁質(zhì)酶的活性也會被Ca2+激活，而被Hg2+抑制［13］。此外，值得注意的是ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶在高鹽條件下具有活性和穩(wěn)定性，這對幾丁質(zhì)酶在低水活度條件下的應(yīng)用具有重要價值。ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶的活性隨著NaCl濃度上升而逐漸下降。最適反應(yīng)鹽濃度為1%，但當(dāng)NaCl濃度為25%時，仍然能保持最大活性的64%。同時，NaCl濃度還能明顯增強(qiáng)熱穩(wěn)定性，ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶在20%NaCl條件下55℃保溫30 min后還能維持近70%的活性。與只有在1 mmol/L NaCl以下才有活性的A. denitrificans幾丁質(zhì)酶相比［13］，ZWW8菌株的幾丁質(zhì)酶有很好的耐鹽性，能在高鹽條件下維持其活性和穩(wěn)定性。高鹽濃度還能促進(jìn)ZWW8菌株幾丁質(zhì)酶對幾丁質(zhì)的特異性結(jié)合，這說明其幾丁質(zhì)酶可能含有幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)，有研究表明高鹽濃度通過增強(qiáng)幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)中芳香族氨基酸殘基與幾丁質(zhì)的疏水相互作用來提高結(jié)合能力［27］。通過幾丁質(zhì)親和層析柱在高鹽條件下對ZWW8菌株的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行了初步純化，SDS-PAGE檢測結(jié)果表明該菌株能分泌多種可特異性結(jié)合幾丁質(zhì)的蛋白質(zhì)，并具有幾丁質(zhì)酶活性。許多微生物能同時分泌內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶和N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶等多種幾丁質(zhì)水解酶。例如，海洋細(xì)菌（Pseudoalteromonas piscicida strain O-7）可產(chǎn)生5個幾丁質(zhì)酶和3個β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶，它們協(xié)同作用降解含幾丁質(zhì)生物質(zhì)，為微生物代謝提供營養(yǎng)［28］。

本研究中Achromobacter sp. ZWW8所分泌的幾丁質(zhì)酶具有耐熱和耐鹽等的優(yōu)良特征，并與已報道的A. denitrificans和A. xylosoxydans的幾丁質(zhì)酶有明顯差異。在后續(xù)研究中，我們將對ZWW8菌株進(jìn)行全基因組測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析該菌株幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，采用代謝調(diào)控手段進(jìn)一步提高幾丁質(zhì)酶表達(dá)量。此外，還將對ZWW8菌株的胞外幾丁質(zhì)酶進(jìn)行蛋白質(zhì)譜檢測，通過與全基因組序列比對獲得各幾丁質(zhì)酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒并對它們進(jìn)行異源表達(dá)和純化，對它們的酶學(xué)性質(zhì)及耐熱耐鹽的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，為開發(fā)在低水活度條件下具有良好活性和穩(wěn)定性的生物催化劑提供新的理論依據(jù)和設(shè)計思路，對于幾丁質(zhì)資源的開發(fā)利用具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本研究以湖北武漢地區(qū)土壤中篩選得到的能降解幾丁質(zhì)膠體的菌株ZWW8為研究對象，通過16S rDNA序列測定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步鑒定該菌株為無色桿菌屬。通過檢測碳源、氮源、溫度、培養(yǎng)基pH和培養(yǎng)時間對幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量的影響對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，Achromobacter sp. ZWW8在添加0.5%幾丁質(zhì)膠體，0.5% NH4Cl，初始pH 7.0的培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)2 d后胞外上清酶活力可達(dá)到33.9 U/L，是優(yōu)化前酶活力的8倍。ZWW8菌株分泌胞外幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)pH為5，最適反應(yīng)溫度為50℃。Ca2+能提高幾丁質(zhì)酶活性，Hg2+、Cu2+和Zn2+等金屬離子能明顯抑制酶活。ZWW8菌株的胞外幾丁質(zhì)酶不僅在高鹽條件維持活性和穩(wěn)定性，還能特異性結(jié)合幾丁質(zhì)，并通過幾丁質(zhì)親和層析對胞外幾丁質(zhì)酶進(jìn)行了初步純化。