李 鑫，潘韜文，潘曉秋，李 坤*

(1.遼寧師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，遼寧 大連 116029;2.大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，遼寧 大連 116044;3.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

《中國(guó)中醫(yī)秘方大全》中記載的結(jié)痂酊是治療燒傷和燙傷的常用藥物,處方是由兒茶、黃芩、黃柏和冰片組成。結(jié)痂酊具有活血化瘀、消腫止痛、收斂生肌等功效，從而促進(jìn)創(chuàng)面快速愈合[1]。結(jié)痂酊中含有豐富的酚酸和黃酮類化合物。從富含酚酸的草藥中尋找促進(jìn)傷口愈合的活性物質(zhì)是藥物篩選的可行方案[2]。本實(shí)驗(yàn)選擇結(jié)痂酊作為研究對(duì)象，采用大孔吸附樹脂純化得到酚酸富集組分，對(duì)酚酸富集組分促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，150只，體重180～220 g,購(gòu)買自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(遼)2008-0002。

1.2 藥物和試劑

兒茶、黃芩、黃柏購(gòu)買自大連百度醫(yī)藥有限公司；沒(méi)食子酸購(gòu)買自溫州甌海精細(xì)化工公司；卡波姆購(gòu)買自青島天力源生物科技有限公司；濕潤(rùn)燙傷膏購(gòu)買自廣州迪康生物科技有限公司；福臨酚試劑、多聚甲醛購(gòu)買自大連萬(wàn)澤貿(mào)易有限公司；95%乙醇購(gòu)買自大連凱美化工工程配套有限公司；水合氯醛購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三乙醇胺購(gòu)買自成都市科龍化工試劑廠；無(wú)水碳酸鈉購(gòu)買自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫化鈉購(gòu)買自天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.3 結(jié)痂酊的制備和純化

結(jié)痂酊制備：將處方中藥物用10倍量的75%乙醇分別超聲提取3次，每次30 min，回收乙醇，干燥稱重。提取物儲(chǔ)存在-20 ℃以備后用。

結(jié)痂酊純化:稱取適量樣品，溶于50%乙醇，緩慢滴加到含HP20的大孔樹脂柱中，用水洗至無(wú)色，然后用10%、30%、50%和70%乙醇溶液洗脫，流速為1 mL/min。合并洗脫液，減壓蒸發(fā)，除去溶劑至干，并在真空烘箱中干燥，得到精制產(chǎn)物儲(chǔ)存在-20 ℃以備后用。

A、B、C、D、E和F分別表示水洗脫組分、10%乙醇洗脫級(jí)分、30%乙醇洗脫組分、50%乙醇洗脫組分、70%乙醇洗脫組分和乙醇提取物。對(duì)于傷口愈合實(shí)驗(yàn)，將100 g提取物(總酚酸含量最多的組分)與50 g卡波姆、250 g甘油、50 mL 1,2-丙二醇和適量三乙醇胺混合，將蒸餾水加至1000 mL[3]。

1.4 Folin法測(cè)定結(jié)痂酊有效組分中總酚含量

采用Folin法測(cè)定結(jié)痂酊不同乙醇洗脫組分中總酚酸含量，每克提取物溶液中沒(méi)食子酸當(dāng)量毫克表示[4]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL分別置25 mL棕色容量瓶中，加Folin-Ciocalteu試劑1 mL，再分別加蒸餾水11.5、11、10、9、8、7 mL，用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)試劑為空白(即用碳酸鈉溶液代替對(duì)照品溶液)，于760 nm處測(cè)吸光值。以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測(cè)定：取0.1 mg/mL A、B、C、D、E、F提取物2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加Folin-Ciocalteu試劑1 mL，再分別加蒸餾水10 mL，用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)試劑為空白(即用碳酸鈉溶液代替對(duì)照品溶液)，于760 nm處測(cè)吸光值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出每克提取物溶液中沒(méi)食子酸當(dāng)量毫克。

1.5 動(dòng)物燙傷模型建立[5]

手術(shù)前24 h用10%硫化鈉褪去大鼠背部的毛，傷前12 h禁食，自由飲水，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5 mL/kg)，按照WALKER和MASON報(bào)道的制作標(biāo)準(zhǔn)建立模型[6]。將大鼠仰臥位固定在木板上,使裸露的背部皮膚暴露在木板孔內(nèi)，進(jìn)而浸于95 ℃水浴中15 s，造成總體表面積30%Ⅲ度燙傷模型，并經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查證實(shí)。傷后腹腔注射生理鹽水(40 mL/kg)進(jìn)行復(fù)蘇，單籠飼養(yǎng)，自由飲水。將大鼠隨機(jī)分為模型組、濕潤(rùn)燒傷膏組和治療組。后兩組每天用藥2次。

1.6 燙傷大鼠中測(cè)定血清中IL-6水平

分別于燙傷前及燙傷后12、24、48、72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6只大鼠。將大鼠處死，采用腹主動(dòng)脈取血4～6 mL，室溫靜置0.5 h后，血樣3000 r/min離心15 min，收集上清液。根據(jù)ELISA試劑盒提供的操作步驟血清IL-6水平。

1.7 病理組織學(xué)觀察

燙傷后3、5、7、14、21 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠,取大鼠燙傷皮膚組織,生理鹽水沖洗，福爾馬林固定，石蠟切片，HE染色觀察。

2 結(jié) 果

2.1 Folin法測(cè)定結(jié)痂酊有效組分中總酚含量結(jié)果

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=107.17x+0.008 8，R2=0.997 7。其中y對(duì)應(yīng)于吸光度，x對(duì)應(yīng)于總酚酸濃度(μg/mL)。

測(cè)量結(jié)果以GAE值表示樣品中總酚含量。結(jié)果顯示，A～F組GAE(mg/g)分別為：338.48±0.042、1093.12±0.036、644.07±0.041、421.29±0.052、371.13±0.055、575.25±0.061,可以看出各組總酚酸含量高低為B>C>F>D>E>A，即B總酚酸含量最高。因?yàn)榉铀岜徽J(rèn)為是有效的化合物，因此研究結(jié)痂酊中B組分對(duì)傷口的愈合作用。

2.2 創(chuàng)面組織病理形態(tài)學(xué)觀察

各組大鼠燙傷后創(chuàng)面組織病理形態(tài)結(jié)果見圖1。

燙傷后3 d，模型組皮膚表皮結(jié)構(gòu)不完整，真皮及皮膚附屬器官明顯受損，可見明顯的充血，部分小血管內(nèi)有血栓形成，真皮下小血管周圍有大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞滲出。濕潤(rùn)燙傷膏組和治療組皮膚表皮結(jié)構(gòu)破損，真皮及皮膚附屬器官受損程度較弱，血栓形成較少，炎癥細(xì)胞滲出較少。

燙傷后5 d，模型組癥細(xì)胞浸潤(rùn)更加明顯，組織可見充血水腫。濕潤(rùn)燙傷膏組和治療組炎性浸潤(rùn)明顯減少，且治療組可見新生小血管。

燙傷后7 d，模型組充血、水腫更加明顯，出現(xiàn)少量的成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管。濕潤(rùn)燙傷膏組和治療組可見結(jié)締組織增生伴有血管再生，且治療組創(chuàng)緣出現(xiàn)肉芽組織。

燙傷后14 d，模型組結(jié)締組織成纖維細(xì)胞明顯增生。濕潤(rùn)燙傷膏組痂皮開始脫落。治療組癡皮下開始有上皮生長(zhǎng)，新生復(fù)層上皮較厚，皮脂腺、汗腺等深部組織結(jié)構(gòu)表淺。

燙傷后21 d，模型組織內(nèi)仍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分創(chuàng)緣有上皮再生。濕潤(rùn)燙傷膏組炎性浸潤(rùn)基本消失結(jié)締組織排列緊密、整齊，可見皮脂腺、汗腺等組織。治療組新生上皮組織較厚且較成熟，結(jié)締組織成纖維細(xì)胞增生更明顯，表皮細(xì)胞排列整齊，創(chuàng)面基本愈合，接近正常皮膚。

2.3 結(jié)痂酊中總酚酸提取物對(duì)血清中IL-6的影響

燙傷前血清中IL-6的含量為(91±13)ng/L,燙傷后血清中IL-6的含量見表1。結(jié)果可見,模型組傷后各時(shí)間點(diǎn)血清中IL-6的含量均顯著高于燙傷前(P<0.05)。燙傷后48 h時(shí)血清中IL-6的含量達(dá)到高峰，濕潤(rùn)燙傷膏組和治療組血清中IL-6含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于模型組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，但都高于燙傷前，且存在顯著差異(P<0.05)。

表 1 血清IL-6的影響

與模型組相比：*P<0.05,**P<0.01;與濕潤(rùn)燙傷膏組相比：ΔP<0.05

3 討 論

結(jié)痂酊中提取的總酚酸可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，降低炎癥因子的水平。研究表明天然藥物中的類黃酮和酚酸具有良好的抗菌和抗氧化作用[7]。酚酸可以使微生物內(nèi)的原生質(zhì)凝聚，從而發(fā)揮抗菌作用。同時(shí)還可以使傷口滲出液中的蛋白質(zhì)凝固形成結(jié)痂膜，從而減少分泌，預(yù)防感染。因此，對(duì)復(fù)方結(jié)痂酊中有效成分提取十分必要，可以為復(fù)方中藥開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)，促進(jìn)現(xiàn)代藥學(xué)科學(xué)技術(shù)在傳統(tǒng)復(fù)方中藥研究中的廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王培麗,孫先軍,鞠昌瑛.燒傷結(jié)痂酊的制備及應(yīng)用[J].中國(guó)民間療法,2014,22(12):25.

[2] PONNUSAMY Y,CHEAR J Y,RAMANATHAN S,et al.Polyphenols rich fraction of Dicranopteris linearis,promotes fibroblast cell migration and proliferation in vitro[J].J Ethnopharmacol，2015,168:305-314.

[3] 王燕萍.中藥燒燙傷凝膠的研制及質(zhì)量控制[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,31(4):63-65.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄62.

[5] 李武全.654-2對(duì)燙傷SD大鼠海馬CA1區(qū)HSP70與Caspase-3表達(dá)的影響[D].昆明:昆明醫(yī)學(xué)院,2009.

[6] WALKER H L,MASON A D Jr.A standard animal burn[J].J Trauma,1968,8(6):1049-1051.

[7] HATANO T,KUSUDA M,INADA K,et al.Effects of tannins and related polyphenols on methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Phytochemistry,2005,66(17):2047-2055.